TMEM16a 反义寡核苷酸恢复囊性纤维化模型的氯外流：机制与治疗潜力

囊性纤维化(CF)是由 CFTR 基因突变引起的常染色体隐性遗传病，现有 CFTR 调节剂(如 ETI)因依赖突变类型，仍有 10-15% 患者(如 I 类突变)无效，亟需 CFTR 非依赖疗法。法国索邦大学 Olivier Tabary 团队在《Molecular Therapy》发表题为Restoring Chloride Efflux in Cystic Fibrosis with TMEM16a Antisense Oligonucleotides的研究：开发靶向 TMEM16a(钙激活氯通道)的反义寡核苷酸(TMEM16a ASO)，通过阻断 miR-9 与 TMEM16a mRNA 3'UTR 结合，恢复 CF 细胞氯外流与黏液纤毛清除;皮下注射可延长 F508del/G542X CF 小鼠寿命(F508del 小鼠从 36 天至 196 天)，50 倍有效剂量无毒性，且对 I/II 类突变均有效，为所有 CF 患者提供新治疗方向。

研究背景

CF 因 CFTR 突变导致氯外流受损、钠过度吸收，引发黏液黏稠阻塞多器官，现有 ENaC 阻滞剂未达临床终点;2008 年发现 TMEM16a(ANO1)为钙激活氯通道，可代偿 CFTR 功能，但 miR-9 会抑制其表达;此前研究证实 TMEM16a ASO 可结合其 3'UTR 阻断 miR-9，需进一步验证其在 CF 模型中的效果、毒性及适用性。

实验方法

纳入 CF 患者原代细胞(I 类 2184delA/W1282X、II 类 F508del)及 F508del/G542X CF 小鼠，TMEM16a ASO 含 LNA 和硫代磷酸修饰(靶向人鼠 TMEM16a 3'UTR);检测氯外流(YFP 探针、Ussing 室)、黏液纤毛清除(荧光珠)、毒性(LDH、细胞因子)、小鼠存活与器官功能，转录组分析特异性，对比 ETI 联用效果。

结果

TMEM16a ASO 在 CF 细胞中剂量依赖性提升氯外流(hBGC 细胞达 50%)，增强黏液纤毛清除;对 I 类突变细胞，ETI 无效但 ASO 有效，与 ETI 联用对 F508del 细胞有协同作用;小鼠皮下注射后 30 天仍可检测 ASO，寿命显著延长，肠道炎症(粪便脂质运载蛋白 / 钙卫蛋白)减轻，雄性生育力恢复，无炎症与毒性。

实验方法

材料准备：TMEM16a ASO(Qiagen 合成，序列 AATCTTTGGTAGTAA，含 LNA 和硫代磷酸修饰)与对照 ASO(ACGTCTATACGCCA);CF 细胞系(CFBE41o-、CUFI-5、CFPAC-1)及原代 hBEC(Epithelix SARL);F508del(129-Cftrtm1Eur)、G542X(Cftr em3Cwt)CF 小鼠，WT 小鼠为对照;试剂包括 Ani9(TMEM16a 抑制剂)、CFTR-Inh172(CFTR 抑制剂)、UTP(钙依赖氯通道激活剂)。

细胞培养与处理：细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养，CFBE41o - 等细胞系转染 ASO(50-200nM)，每日 1 小时共 3 天;原代 hBEC 在气液界面(ALI)培养，ETI(Elexacaftor 3μM+Tezacaftor 10μM+Ivacaftor 1μM)处理 24 小时作对照;铜绿假单胞菌 PAO1 株(MOI 0.01-10)用于细菌实验。

功能检测：氯外流用卤化物敏感 YFP-H148Q/I152L 探针(碘淬灭法)及 Ussing 室(测短路电流 Isc);黏液纤毛清除通过荧光珠运动速度量化;Western blot 检测 TMEM16a 蛋白，qPCR 验证 mRNA 表达;细菌生长用发光法监测，结晶紫染色评估细胞感染率。

毒性与特异性检测：LDH 法测细胞毒性(CFBE41o - 细胞 24 小时处理);ELISA 检测 IL-8(CF 肺部主要细胞因子);Fluo-4 染色评估钙动员，CyQUANT NF 法测增殖;转录组分析(Illumina HiSeq 4000)比较 ASO 与对照处理细胞的基因表达，验证 TMEM16a 特异性(TOP10 高表达基因)。

动物实验与统计：小鼠皮下注射 ASO(10mg/kg，出生 11/18 天初治，断奶后每 15 天一次)，荧光 ASO 追踪分布;监测存活(Kaplan-Meier 曲线)、体重、粪便炎症标志物;500mg/kg(50 倍有效剂量)评估毒性(组织学、ALT/AST/ 尿素等血液指标);用 GraphPad Prism 10.5 做 ANOVA(Bonferroni 校正)，R 软件做线性混合效应模型，p<0.05 为显著。

关键结果

图1：TMEM16a ASO 提升 F508del 细胞氯外流

该图证实 ASO 的氯通道激活作用：HEK 细胞转染 TMEM16a 3'UTR 荧光素酶载体，ASO 处理后荧光素酶活性升高(证实结合 3'UTR);CFBE41o - 细胞中，ASO(25nM 起)剂量依赖性增强氯外流(YFP 探针检测)，KM4、hBEC 等 F508del 细胞氯外流提升 20-50%;Ussing 室显示，ASO 处理 CF hBEC 的 UTP 诱导钙依赖氯电流升高，Ani9 可阻断该效应，证实 TMEM16a 特异性。

图2：ASO 对不同 CF 突变细胞的效果

该图验证 ASO 的突变普适性：I 类突变(2184delA/W1282X)hBEC 经 ASO 处理后，UTP 响应显著增强(p<0.01)，黏液纤毛清除速度提升;ETI 对 F508del 细胞有效但对 I 类突变无效，ASO 对两类突变均有效，且与 ETI 联用对 F508del 细胞有协同作用;ASO 对铜绿假单胞菌生长及细胞感染率无影响，排除抗菌干扰。

图3：ASO 的特异性与无毒性

该图证实 ASO 安全性：体外药物筛选显示 ASO 无脱靶结合;CFBE41o - 细胞 200nM ASO 处理后 LDH 无升高，IL-8 分泌无增加;不同 CF 突变细胞的钙动员与增殖无显著变化;转录组分析显示，ASO 处理后 TMEM16a 为 TOP10 高表达基因，无炎症 / 毒性相关基因上调，证实特异性与安全性。

图4：ASO 的体内分布与毒性

该图确定最优给药途径：小鼠静脉 / 皮下 / 腹腔 / 鼻内给药，皮下注射的 ASO 在肺、肝、肠等器官分布最优，30 天仍可检测且 TMEM16a mRNA 升高;500mg/kg 处理后，小鼠行为、组织学及 ALT/AST/ 尿素等指标正常，1 年长期处理无中性粒细胞浸润(MPO 量化)，证实皮下给药安全。

图5：ASO 对 F508del 小鼠的治疗效果

该图显示 ASO 对 F508del 小鼠的改善：ASO 处理后小鼠寿命从 36 天延至 196 天(p<0.0001)，体重接近 WT;粪便脂质运载蛋白 / 钙卫蛋白降低(肠道炎症减轻);雄性小鼠输精管畸形率从 79.1% 降至 18.75%，生育力从 4.16% 升至 88.23%;母鼠 ASO 可传给幼崽，后代存活延长。

图6：ASO 对 G542X 小鼠的治疗效果

该图验证 ASO 对另一突变的有效性：G542X 小鼠经 ASO 处理后，寿命从 106 天延至 205 天(p<0.0001)，体重无显著差异;粪便炎症标志物(脂质运载蛋白 / 钙卫蛋白)显著降低，与 F508del 小鼠结果一致，证实 ASO 对不同 CF 突变的普适性。

研究结论

TMEM16a ASO 通过竞争性结合 TMEM16a mRNA 3'UTR 阻断 miR-9 抑制，恢复 CF 细胞的氯外流与黏液纤毛清除，且不依赖 CFTR 突变类型，对 I/II 类 CF 突变均有效;皮下注射给药在 CF 小鼠中安全性高(50 倍剂量无毒性)，可显著延长寿命、减轻肠道炎症、恢复雄性生育力，且能通过母鼠传递给幼崽发挥保护作用;该 CFTR 非依赖策略填补了现有药物对 I 类突变患者无效的空白，为所有 CF 患者提供新治疗方案，但研究局限于细胞与小鼠模型(CF 小鼠肺部病变轻)，未来需在雪貂 / 猪等大动物模型验证肺部效果，并扩大临床样本评估长期安全性。