MeCP2 失调通过抑制线粒体自噬损害皮质类器官神经发育的研究

MeCP2(甲基化 CpG 结合蛋白 2)在神经系统正常发育中起关键作用，其突变与 Rett 综合征等神经发育障碍相关，可能与线粒体功能异常及线粒体自噬(mitophagy)受损有关，但具体机制尚未明确。传统研究模型难以模拟人类皮质发育的复杂过程，而皮质类器官(COs)能再现神经发生的时空特征，为探究 MeCP2 调控神经发育的机制提供理想平台。本研究通过 MeCP2 突变诱导多能干细胞(iPSCs)分化的 COs，揭示其通过调控线粒体自噬影响神经发育的分子机制。

来自西安交通大学的团队在《Journal of Advanced Research》期刊发表了题为“MeCP2 dysregulation inhibits mitophagy and impairs neural development in cortical organoids”的研究。

核心内容如下：

模型构建与表型分析：利用 CRISPR-Cas9 构建 MeCP2 c.269_275del(p.D90_R91del)突变 iPSCs，分化为皮质类器官(COs)，发现突变型 COs 生长受抑(体积减小)，神经干细胞增殖能力下降(Ki67+、BrdU + 细胞减少)，分化异常(成熟神经元标志物 MAP2 + 细胞减少，未成熟神经元 imNeuron2 积累)，模拟 Rett 综合征的微脑表型。

线粒体自噬与功能异常：单细胞 RNA 测序显示突变型 COs 中关键线粒体自噬受体 BNIP3L 显著下调;MeCP2 可结合 BNIP3L 的转录起始位点(TSS)促进其转录，突变后 BNIP3L 表达受抑，导致线粒体自噬障碍(LC3 与线粒体标记 TOM20 共定位减少，自噬底物 p62 积累);同时线粒体膜电位降低、ROS 积累、形态碎片化，氧化磷酸化功能受损(氧消耗率、ATP 生成下降)。

机制验证与功能恢复：MeCP2 敲除实验重现突变型表型，证实其对线粒体自噬的调控作用;过表达 BNIP3L 可部分恢复突变型 COs 的线粒体自噬功能，改善线粒体膜电位和 ROS 积累，缓解神经发育异常。

实验结果

图 1：MeCP2 突变 iPSCs 的构建与表征

内容：展示从健康男性成纤维细胞重编程生成 iPSCs，通过 CRISPR-Cas9 引入 MeCP2 c.269_275del 突变( exon3 区域 6bp 缺失);验证突变 iPSCs 的多能性标志物(OCT4、SOX2 等)表达，克隆形成实验显示其单细胞存活率降低;核型分析证实染色体正常(46, XY)。

图 2：MeCP2 突变 COs 的生长与神经干细胞异常

内容：展示 COs 的诱导流程(双 SMAD 抑制剂诱导神经外胚层，bFGF/EGF 扩增神经干细胞，BDNF/NT3 促进分化);明场图像显示突变型 COs 在第 6-50 天体积显著小于对照组;免疫荧光显示突变型 COs 中 Ki67 + 增殖细胞、BrdU + 分裂细胞减少，SOX2 + 神经干细胞分化异常(成熟神经元 MAP2 + 细胞减少)。

图 3：单细胞测序揭示突变型 COs 的细胞类型与分化轨迹异常

内容：UMAP 分析显示对照组与突变型 COs 的 13 个细胞集群(包括 NPC、vRG、成熟神经元等);突变型 COs 中 NPC 和 vRG 比例下降，未成熟神经元 imNeuron2 比例显著升高(35.93% vs 对照组 1.57%);伪时间分析显示突变型 COs 分化轨迹异常，imNeuron2 无法分化为成熟神经元;细胞周期分析显示 imNeuron2 的 G2/M 期比例降低，S 期阻滞。

图 4：突变型 COs 的线粒体功能与自噬相关基因表达异常

内容：神经元集群中 DEGs 显示 MAP1B、DSCAM 等神经发育异常基因上调;径向胶质细胞(RGs)中 DEGs 富集线粒体组织、氧化磷酸化通路，mtDNA 基因(MT-CO1、MT-ATP6)表达异常;KEGG 分析显示 RGs 和神经元中自噬通路下调，BNIP3L 等线粒体自噬基因表达降低。

图 5：突变型 COs 的线粒体功能与自噬缺陷

内容：JC-1 染色显示突变型 COs 线粒体膜电位降低(绿色单体增多);ROS 检测显示荧光强度升高; Seahorse 实验显示氧消耗率、ATP 生成下降;线粒体形态分析显示突变型为短圆形碎片;免疫荧光显示 LC3 与 TOM20 共定位减少，Western blot 显示 LC3-II/I 比例下降、p62 和 TOM20 积累;MeCP2 敲除实验重现自噬缺陷。

图 6：MeCP2 通过结合 BNIP3L 的 TSS 调控其转录

内容：qPCR 和 Western blot 显示突变型 COs 中 BNIP3L 在 mRNA 和蛋白水平均下调;CUT&Tag 数据显示 MeCP2 结合 BNIP3L 的 TSS，突变后结合信号减弱;双荧光素酶报告基因实验证实 MeCP2 促进 BNIP3L 转录，突变型无此作用;ChIP-qPCR 验证 MeCP2 在 BNIP3L TSS 的富集减少。

图 7：过表达 BNIP3L 恢复突变型 COs 的线粒体功能与自噬

内容：BNIP3L 敲除导致对照组 COs 出现线粒体膜电位降低、ROS 升高、LC3-TOM20 共定位减少;过表达 BNIP3L 使突变型 COs 的线粒体膜电位部分恢复、ROS 降低、LC3-TOM20 共定位增加;Western blot 显示 p62 和 TOM20 水平下降，证实自噬功能改善。

全文总结

本研究通过 MeCP2 突变皮质类器官模型，证实 MeCP2 通过直接结合线粒体自噬受体 BNIP3L 的转录起始位点促进其表达，调控线粒体自噬;MeCP2 突变导致 BNIP3L 表达受抑，引发线粒体功能异常(膜电位降低、ROS 积累、形态碎片化)和自噬障碍，最终导致神经干细胞增殖分化异常及神经发育缺陷。过表达 BNIP3L 可部分逆转上述异常，为 Rett 综合征等 MeCP2 相关神经发育障碍提供了 “MeCP2-BNIP3L - 线粒体自噬” 的新发病机制和潜在治疗靶点。未来需结合体内模型验证，推动靶向线粒体自噬的临床转化。