基于吡唑的大环激酶抑制剂的设计与合成及对 BMPR2 的靶向作用

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Design and Synthesis of Pyrazole-Based Macrocyclic Kinase Inhibitors Targeting BMPR2

中文标题：基于吡唑的大环激酶抑制剂的设计与合成及对 BMPR2 的靶向作用

发表期刊：《ACS Medicinal Chemistry Letters》

影响因子：4.0

作者单位：

1.Institute for Pharmaceutical Chemistry, Johann Wolfgang Goethe-University, D-60438 Frankfurt am Main, Germany

2.Structure Genomics Consortium, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences, Johann Wolfgang Goethe-University, D-60438 Frankfurt am Main, Germany

3.German Cancer Consortium (DKTK), German Cancer Research Center (DKFZ), 69120 Heidelberg, Germany

4.Department of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Chemistry, National and Kapodistrian University of Athens, 15771 Athens, Greece

作者信息：

Jennifer A. Amrhein¹,², Guiqun Wang¹,²,³, Benedict-Tilman Berger¹,², Lena M. Berger¹,², Amalia D. Kalampaliki⁴, Andreas Krämer¹,²,³, Stefan Knapp¹,²,³,⁎, Thomas Hanke¹,²,⁎

研究背景

骨形态发生蛋白受体 2(BMPR2)属于酪氨酸激酶样(TKL)家族的丝氨酸 / 苏氨酸受体激酶，其信号通路失调与肺动脉高压、阿尔茨海默病及癌症等多种疾病密切相关。目前激酶抑制剂研发多聚焦于 I 型受体，针对 II 型受体(如 BMPR2)的抑制剂不仅数量少，且普遍存在选择性差的问题(如 JNJ-28312141、尼达尼布等为广谱激酶抑制剂)。化合物 1 是基于 3 - 氨基 - 1H - 吡唑铰链结合基团的广谱激酶抑制剂，可抑制 468 种激酶中的 262 种。本研究通过对化合物 1 进行大环化改造，旨在提升其对 BMPR2 的选择性与活性，开发出可用于基础研究的 BMPR2 靶向工具化合物。

研究方法

本研究以化合物 1 为先导结构，采用 “引入大环化官能团 - 改变连接臂结构与长度” 的策略设计合成大环抑制剂(Scheme 1)：先通过亲核取代反应在化合物 2 中引入 2,4 - 二氯嘧啶得到中间体 4，再连接不同类型 / 长度的连接臂，经 Boc 脱保护、皂化得到前体 7a-e，最后通过 HATU 介导的酰胺缩合完成大环化，获得目标化合物 8a-e;采用差示扫描荧光法(DSF)筛选化合物的激酶结合选择性;通过等温滴定量热法(ITC)测定化合物与 BMPR2 的结合亲和力及热力学参数;利用 ADP-Glo 激酶活性分析测定对 BMPR2 的抑制活性(IC₅₀);借助 NanoBRET 技术评估化合物对 GSK3A/B 等潜在脱靶激酶的细胞活性;通过 KINOMEscan 平台(468 种激酶)验证化合物的全激酶组选择性;采用分子对接技术预测化合物 8a 与 BMPR2 的结合模式。

实验结果

图 1：现有 bmpr2 抑制剂、化合物 1 的特性及大环化合成策略

该图奠定研究基础：图 1A 展示现有 BMPR2 抑制剂的结构与活性，多数为广谱抑制剂(如 JNJ-28312141 的 Kd=310nM，尼达尼布 IC₅₀=56nM)，仅 CDD-1115/1653 为高选择性抑制剂;图 1B-C 显示化合物 1 的全激酶组选择性极差，1μM 浓度下可强效抑制 262 种激酶;图 1D 为化合物 1 与 VRK1 的共晶结构，其 3 - 氨基吡唑可与 VRK1 的 D132、F134 形成相互作用，嘧啶环嵌入疏水口袋;图 1E 提出大环化策略，通过引入官能团并改变连接臂实现选择性优化。

图 2：化合物 1 与 8a 对 BMPR2 的 ITC 结合分析

该图验证结合亲和力与热力学特性：化合物 1 与 BMPR2 的结合常数 Kd=186nM，结合过程以焓驱动为主(ΔH=-9.605kcal/mol)，熵变不利(-TΔS 为正值);化合物 8a 与 BMPR2 的结合亲和力显著提升(Kd=83.5nM)，结合过程兼具焓驱动(ΔH=-8.409kcal/mol)与熵驱动(-TΔS 为负值)，表明大环化带来的构象限制和疏水作用改善了结合熵，增强了结合能力(图 2A-B)。

图 3：化合物的酶活与选择性表征

该图证实 8a 的高选择性与活性：ADP-Glo 实验显示，化合物 1 对 BMPR2 的抑制活性最强(IC₅₀=36.2nM)，8a 的 IC₅₀为 506nM，8b/8c 活性稍弱(IC₅₀=461nM/630nM);NanoBRET 实验表明，化合物 1 对 GSK3A/B 的细胞活性极强(IC₅₀=4.0nM/1.0nM)，而 8a 对 GSK3A/B 的抑制活性显著降低(IC₅₀=10.9μM/33.6μM)，脱靶风险大幅下降(图 3A);DSF 实验显示 8a 仅能显著稳定 BMPR2(ΔTm=5.8℃)和 GSK3B(ΔTm=8.4℃)两种激酶，远优于化合物 1 的广谱结合特性(图 3B-C);KINOMEscan 全激酶组分析显示 8a 的选择性评分 S₃₅=0.01，仅对 BMPR2 具有强效抑制活性，脱靶激酶(如 FLT3 (D835V)、GSK3A)活性极弱(图 3D-F)。

图 4：化合物 8a 与 BMPR2 的分子对接结合模式

该图揭示分子作用机制：对接结果显示 8a 为 ATP 模拟结合模式，其吡唑基团可与 BMPR2 铰链区的 Y282 形成 2 个氢键，连接嘧啶与芳香环的氨基可与 S350 形成额外氢键;同时 8a 可与 I209、V217、L340 产生疏水相互作用;大环连接臂的空间位阻迫使三个芳香环偏离平面构象，降低了构象灵活性，从而实现对 BMPR2 的特异性结合(图 4A-B)。

研究结论

本研究以广谱激酶抑制剂 1 为先导，通过大环化改造成功开发出高选择性 BMPR2 靶向抑制剂 8a。核心成果包括：1)通过优化连接臂的结构与长度，将化合物 1 的广谱结合特性转化为 8a 的 BMPR2 特异性结合，8a 对 BMPR2 的结合亲和力 Kd=83.5nM，酶抑制活性 IC₅₀=506nM;2)热力学分析表明 8a 的结合兼具焓 - 熵驱动优势，克服了先导化合物 1 的熵不利缺陷;3)全激酶组选择性验证显示 8a 的脱靶风险极低，仅对极少数激酶有弱活性;4)分子对接阐明 8a 与 BMPR2 的 ATP 口袋特异性结合模式。该研究证实大环化是改善激酶抑制剂选择性的有效策略，8a 为 BMPR2 信号通路研究提供了优质的体外工具化合物，为后续疾病靶向治疗药物研发奠定了基础。