靶向炎症核心枢纽 CEBPD！高通量筛选发现 BET/HDAC 抑制剂兼具表观调控与抗炎活性

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：High-Throughput Screening for CEBPD-Modulating Compounds in THP-1-Derived Reporter Macrophages Identifies Anti-Inflammatory HDAC and BET Inhibitors

中文标题：靶向 CEBPD 的抗炎化合物高通量筛选：发现具备抗炎活性的 BET 与 HDAC 抑制剂

发表期刊：《International Journal of Molecular Sciences》

影响因子：4.9

作者单位：

1.Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology ITMP, Theodor-Stern-Kai 7, 60596 Frankfurt am Main, Germany

2.Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology ITMP, Schnackenburgallee 114, 22525 Hamburg, Germany

3.EpiEndo Pharmaceuticals ehf, Eiðistorg 13-15, 170 Seltjarnarnes, Iceland

作者信息：

Tatjana Ullmann¹,⁎, Sonja Luckhardt¹, Markus Wolf², Michael J. Parnham¹,³, Eduard Resch¹

研究背景

CCAAT / 增强子结合蛋白 δ(C/EBPδ，由CEBPD基因编码)是巨噬细胞炎症反应的核心转录因子，其表达主要在基因转录起始水平受调控，可整合多种炎症信号通路，同时兼具促炎与抗炎的双重调控作用。目前已知可靶向CEBPD表达的抗炎化合物(如迷迭香酚、白藜芦醇类似物)数量极少，且作用机制尚不明确。为挖掘新型CEBPD调控化合物并探究其抗炎潜力，本研究构建了CEBPD启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告细胞系，通过高通量筛选小分子文库，鉴定出具备表观调控活性的抗炎化合物，为炎症驱动性疾病的治疗提供新靶点与候选药物。

研究方法

本研究首先构建含CEBPD近端启动子(332 bp)的CEBPD::SEAP 报告载体，分别转染 HEK293T 和经慢病毒转导 THP-1 细胞，建立稳定报告细胞系;对 SEAP 化学发光检测法进行表征，验证其线性、灵敏度(Z´- 因子)与重复性(变异系数 CV);采用佛波酯(PMA)诱导 THP-1 报告细胞分化为巨噬细胞，经 LPS+IFN-γ 激活为 M1 型巨噬细胞;基于该模型高通量筛选LOPAC®1280和ENZO®774文库(共 2054 个化合物)，以 SEAP 分泌水平为核心指标筛选CEBPD调控化合物;通过 CellTiter-Glo® 实验排除化合物的细胞毒性;借助 qRT-PCR 验证候选化合物对内源性CEBPD、报告基因CEBPD::SEAP 及炎症因子(IL-6、IL-1β、CCL2)的 mRNA 表达影响。

实验结果

图 1：SEAP 化学发光检测法的性能表征

该图验证报告系统的可靠性：图 1A 显示 CMV 启动子驱动 SEAP 的 HEK293T 报告细胞培养上清中可检测到显著酶活性，空载细胞无背景信号;图 1B 证实 SEAP 检测法在 1~10000 倍稀释范围内线性良好(R²=0.99);图 1C 及表 1 显示检测法灵敏度高(1000 倍稀释样本 Z´- 因子 = 0.7)，重复性优异(1000 倍稀释内样本的批内 CV<10%、批间 CV<5%)，符合高通量筛选的技术要求。

图 2：THP-1 来源CEBPD::SEAP 报告巨噬细胞系的验证

该图确认报告细胞系的生物学适配性：图 2A-B 展示CEBPD::SEAP 载体结构，其CEBPD启动子包含 SP1、CREB 等已知转录因子结合位点及 NF-κB、ATF3 等预测结合位点;图 2C 表明未分化 THP-1 报告细胞 SEAP 分泌为背景水平，PMA 诱导分化及后续恢复期可检测到 SEAP 分泌显著激活;图 2D-E 显示 LPS+IFN-γ 处理后，内源性CEBPD与报告基因CEBPD::SEAP 的 mRNA 表达趋势一致、上调倍数相近;图 2F 证实报告细胞上清中 SEAP 酶活性在刺激后 24 h 达到峰值，与基因表达的滞后效应相符，表明该报告细胞系可准确反映CEBPD的转录激活状态。

图 3：CEBPD调控化合物的高通量筛选流程与结果

该图完成候选化合物的初筛与鉴定：图 3A 为筛选流程，PMA 分化的 THP-1 报告巨噬细胞经化合物预处理 1 h 后，用 LPS+IFN-γ 激活 24 h 并检测 SEAP 分泌;图 3B-C 展示 * LOPAC®和ENZO®* 文库的筛选散点图，以 M1 型溶剂对照组信号均值 + 3 倍标准差为阈值，筛选出 4 个可显著激活 SEAP 分泌的表观活性化合物 ——2 个 BET 抑制剂(IBET151、Ro 11-1464)和 2 个 HDAC 抑制剂(SAHA、TSA);细胞活力实验证实，候选化合物的 SEAP 激活效应与细胞增殖 / 毒性无关，排除假阳性结果。

图 4：BET 抑制剂 IBET151 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图揭示 IBET151 的调控特性：图 4A 显示 IBET151 可显著上调 LPS+IFN-γ 激活巨噬细胞的 SEAP 分泌;图 4B-C 证实其可同时上调报告基因CEBPD::SEAP 和内源性CEBPD的 mRNA 表达;抗炎活性方面，IBET151 可显著抑制IL-6(抑制倍数 > 65 倍)和CCL2(抑制倍数 > 15 倍)的 mRNA 表达，但同时会使IL-1β的 mRNA 表达翻倍，呈现 “抗炎为主、局部促炎” 的双向调控特征。

图 5：BET 抑制剂 Ro 11-1464 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图体现 Ro 11-1464 的调控特异性：图 5A 表明 Ro 11-1464 可显著激活 SEAP 分泌;图 5B-C 显示其对CEBPD::SEAP 和内源性CEBPD的上调效应与 IBET151 类似;抗炎层面，Ro 11-1464 可抑制IL-6和CCL2的 mRNA 表达(抑制倍数均约 9 倍)，但对IL-1β的表达无显著影响，相较于 IBET151 的炎症因子调控更具选择性。

图 6：HDAC 抑制剂 SAHA/TSA 对 SEAP 分泌及基因表达的影响

该图揭示 HDAC 抑制剂的特殊调控模式：图 6A 显示 SAHA 和 TSA 均可激活 SEAP 分泌;图 6B-C 发现其对报告基因CEBPD::SEAP 的上调与对内源性CEBPD的完全抑制形成反向效应(推测与启动子片段长度导致的转录调控元件缺失相关);抗炎活性上，SAHA 和 TSA 可强效抑制IL-6(抑制倍数 > 110 倍)和CCL2(抑制倍数 > 15 倍)，同时轻度上调IL-1β的 mRNA 表达，与 BET 抑制剂的抗炎谱类似但CEBPD调控机制相反。

研究结论

本研究成功构建 THP-1 来源的CEBPD::SEAP 报告巨噬细胞模型，通过高通量筛选鉴定出 4 种可调控CEBPD表达的表观活性化合物(2 种 BET 抑制剂、2 种 HDAC 抑制剂)。核心发现包括：1)BET 抑制剂可同时上调报告基因与内源性CEBPD，HDAC 抑制剂则呈现 “报告基因激活、内源性基因抑制” 的反向调控;2)所有候选化合物均具备显著抗炎活性，可强效抑制IL-6和CCL2的表达，但部分化合物会轻度上调IL-1β;3)CEBPD的表达调控与炎症因子的平衡密切相关，其作为炎症核心枢纽的作用机制需进一步探究。该研究为炎症驱动性疾病(如类风湿关节炎、动脉粥样硬化)提供了新的治疗靶点和候选药物，同时也深化了对CEBPD在巨噬细胞炎症反应中复杂功能的认知。