物种特异性星形胶质细胞条件培养基促进人类类器官神经元成熟的方案研究

脑类器官作为神经科学研究的重要模型，其应用常受限于神经元成熟度不足 —— 突触复杂性低、电生理活性弱且分层结构不完善。星形胶质细胞通过分泌营养因子、调节突触形成等方式在神经元成熟中发挥关键作用，但传统培养体系难以模拟其体内调控效应。本研究建立了一种生成物种特异性星形胶质细胞条件培养基(ACM)的方案，通过提取小鼠和人类星形胶质细胞的分泌产物，显著促进人类 2D 神经细胞和 3D 前脑类器官的神经元成熟，为解决类器官成熟瓶颈提供了实用工具。

来自清华大学深圳国际研究生院等机构的 Honghui Zheng、Wenxin Xu、Shaohua Ma 团队在《STAR Protocols》期刊发表了题为“Protocol to generate species-specific astrocyte-conditioned medium for human organoid neuron maturation”的方案。

核心内容如下：

ACM 制备流程：

从小鼠幼崽(出生后 1-3 天)分离大脑皮质星形胶质细胞，经差异贴壁和机械振荡纯化(纯度 > 95%)，培养至第 23-28 天收集条件培养基(MACM);

人类星形胶质细胞来自商业来源，培养至融合后收集条件培养基(HACM);

经离心去除细胞碎片、0.22μm 过滤灭菌，通过 BCA 蛋白定量和 SDS-PAGE 验证培养基质量。

质量控制：通过免疫荧光验证星形胶质细胞标志物(GFAP)，排除微胶质细胞(IBA1)和少突胶质细胞(RIP)污染;蛋白质谱显示小鼠与人类 ACM 的分泌蛋白存在高度重叠，证实跨物种应用的可行性。

应用效果：

在 2D 培养中，ACM 可促进神经前体细胞(NPCs)分化为成熟神经元，增加 MAP2(成熟神经元标志物)表达;

在 3D 前脑类器官中，ACM 处理使神经元层厚度增加，钙成像和多电极阵列(MEA)显示电生理活性显著增强(如同步爆发活动增多)，且分层结构更接近体内特征。

图 1：神经前体细胞和前脑神经元前体的单层培养流程

展示从人类 H9 胚胎干细胞诱导神经前体细胞(NPCs)的步骤 —— 通过 mTeSR Plus 培养基维持干细胞状态，经 STEMdiff SMADi 诱导分化为 NPCs，再用前脑神经元分化培养基诱导为前脑神经元前体，全程需 4-5 周。

图 2：未成熟前脑类器官的生成过程

明场图像显示类器官发育关键阶段 —— 第 0 天干细胞聚集成胚状体，第 9 天形成神经上皮结构，第 14 天嵌入 Matrigel 后开始分层。

图 3：星形胶质细胞培养与验证

小鼠星形胶质细胞经分离、纯化后呈典型扁平形态，免疫荧光显示高表达 GFAP，几乎无 IBA1 和 RIP 阳性细胞;

人类星形胶质细胞培养后呈梭形，融合后形成致密单层，同样验证 GFAP 阳性且无其他胶质细胞污染。

图 4：ACM 的质量控制

BCA 定量显示 MACM 和 HACM 的蛋白浓度显著高于空白对照;SDS-PAGE 凝胶染色显示两者均含丰富蛋白质条带(分子量分布广泛)，且物种间存在共有的核心蛋白组分。

图 5：ACM 促进神经元成熟的效果

3D 类器官经 MACM 处理后，第 90 天的神经元层(TUJ1+/MAP2+)厚度显著增加，SOX2(神经前体标志物)表达减少，提示成熟加速;

钙成像显示 MACM 处理组的 ΔF/F 振幅更大，MEA 记录到更频繁的网络爆发活动，证实电生理活性增强;

蛋白质谱显示小鼠与人类星形胶质细胞分泌蛋白存在 304 种共有成分，为跨物种应用提供分子依据。

全文总结

本方案详细描述了物种特异性星形胶质细胞条件培养基(ACM)的制备、质控及应用，通过标准化流程解决了脑类器官神经元成熟不足的问题。MACM 在促进 3D 前脑类器官分层、突触形成和电生理活性方面效果显著，且与人类 ACM 共享核心分泌蛋白，为跨物种研究提供实用工具。局限性包括依赖小鼠星形胶质细胞可能引入种间差异，以及血清成分带来的批次变异。该方案为神经发育研究、疾病建模及药物筛选提供了更接近体内状态的类器官模型，具有广泛的应用价值。