避坑指南：红移萤火虫荧光素酶引发免疫排斥，CBG-GFP 才是肿瘤免疫研究优选

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Immune Response to Bioluminescence Imaging Reporters in Murine Tumor Models

中文标题：小鼠肿瘤模型中生物发光报告基因的免疫反应研究

发表期刊：《Molecular Imaging and Biology》

影响因子：2.5

作者单位：

1. Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, Morgantown, WV 26506, USA

2. Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center, Morgantown, WV 26506, USA

3. WVU Cancer Institute, West Virginia University, Morgantown, WV 26506, USA

作者信息：

Angisha Basnet¹, Dylan D. Thomas¹, Kaitlyn M. Landreth¹, F. Heath Damron¹,², Tracy W. Liu¹,³*

研究背景

生物发光报告基因广泛用于肿瘤研究的实时无创成像，但在免疫健全小鼠模型中，非哺乳动物来源的报告基因可能被识别为外源抗原，引发免疫反应，干扰肿瘤 - 免疫相互作用研究。本研究对比两种常用生物发光报告基因(红移萤火虫荧光素酶 RLuc、叩甲绿荧光素酶 CBG)的免疫原性，评估其对免疫健全小鼠肿瘤模型的影响，为肿瘤免疫研究选择合适报告基因提供依据。

研究方法

本研究选用 4 种癌细胞系(胰腺导管腺癌 KPCY6419、KPCY6422;黑色素瘤 YUMM1.7、YUMM3.3)，分别稳定表达 RLuc-GFP(红移萤火虫荧光素酶 + 绿色荧光蛋白)和 CBG-GFP(叩甲绿荧光素酶 + 绿色荧光蛋白);通过台盼蓝计数评估体外增殖能力，生物发光成像验证报告基因表达;向 C57BL/6 免疫健全小鼠皮下注射癌细胞，监测体内成瘤情况;流式细胞术分析肿瘤及脾脏免疫细胞组成与激活状态，细胞因子阵列和 ELISA 检测分泌型细胞因子水平;利用正交胰腺肿瘤模型、黑色素瘤转移模型及皮肤窗 chamber 模型，验证 CBG-GFP 的体内成像适用性。

实验结果

图1：RLuc-GFP 报告基因对 PDAC 细胞体外增殖及体内成瘤的影响

该图显示 RLuc-GFP 的免疫原性干扰：KPCY6419 和 KPCY6422 细胞稳定表达 RLuc-GFP 后，体外增殖能力与亲本细胞无显著差异(图 1a-b)，且生物发光信号稳定(图 1c);但在免疫健全小鼠中，RLuc-GFP 阳性细胞无法形成可触及肿瘤(图 1d-e);KPCY6419 RLuc-GFP 细胞体外分泌 KC、LIX、MCP-1 细胞因子水平显著升高，而 KPCY6422 RLuc-GFP 细胞无明显变化(图 1f-g)，提示 RLuc-GFP 引发的免疫反应与细胞系特性相关。

图2：CBG-GFP 报告基因对肿瘤细胞体外增殖的影响

该图证实 CBG-GFP 对体外生长无干扰：4 种癌细胞系(KPCY6419、KPCY6422、YUMM1.7、YUMM3.3)稳定表达 CBG-GFP 后，体外增殖速率与亲本细胞无显著差异(图 2a-d);生物发光成像验证 CBG-GFP 表达稳定，且信号强度与细胞数量呈正相关(图 2e、图 S2)，表明 CBG-GFP 不影响肿瘤细胞基础生长特性。

图3：CBG-GFP 报告基因对肿瘤细胞体内成瘤的影响

该图验证 CBG-GFP 的体内适用性：4 种 CBG-GFP 阳性癌细胞在免疫健全小鼠中均能形成皮下肿瘤，生长速率与亲本细胞无显著差异(图 3a-d);生物发光成像可实时追踪肿瘤生长，信号强度随肿瘤体积增大而升高(图 3e、图 S3);B16F10 黑色素瘤细胞中，CMV 启动子和泛素启动子驱动的 CBG-GFP 均不影响体内外生长(图 S4a-b)，证实启动子对免疫原性影响极小。

图4：CBG-GFP 报告基因对肿瘤细胞分泌型细胞因子的影响

该图显示 CBG-GFP 对细胞因子的轻微调控：KPCY6419 CBG-GFP 细胞 KC 和 LIX 水平降低，KPCY6422 CBG-GFP 细胞 KC 水平升高，YUMM1.7 CBG-GFP 细胞 IP-10、MCP-1、RANTES 水平升高，而 YUMM3.3 CBG-GFP 细胞无显著变化(图 4a-g);B16F10 CBG-GFP 细胞 IP-10 和 RANTES 水平升高(图 S4d-e)，但这些变化未对应体内肿瘤生长异常，提示细胞因子改变不影响整体成瘤能力。

图5：报告基因对肿瘤免疫组成及 T 细胞激活的影响

该图明确 CBG-GFP 对免疫微环境的低干扰性：多数 CBG-GFP 阳性肿瘤的免疫细胞组成与亲本肿瘤无显著差异，仅 KPCY6419 CBG-GFP 肿瘤 CD4⁺T 细胞轻微升高(约 1.7% 至 3%)，且整体占比极低(图 5a-d);RLuc-GFP 阳性细胞接种后，小鼠脾脏中 CD8⁺CD25⁺激活型 T 细胞、CD8⁺GranzymeB⁺细胞毒性 T 细胞及 CD4⁺CD25⁺激活型 T 细胞显著增多(图 5e-f)，证实 RLuc-GFP 引发适应性免疫反应，导致肿瘤排斥。

图6：CBG-GFP 报告基因的体内成像应用

该图展示 CBG-GFP 的多场景适用性：正交胰腺肿瘤模型中，CBG 生物发光与 3D CT 成像可精准定位肿瘤位置(图 6a);黑色素瘤转移模型中，生物发光可无创追踪肺和骨骼转移灶(图 6b);皮肤窗 chamber 模型中，可同步实现 CBG 生物发光宏观成像与 GFP 荧光微观成像，观察肿瘤结构及血管形成(图 6c-d)，体现双报告基因的互补优势。

研究结论

本研究明确两种生物发光报告基因的免疫原性差异：红移萤火虫荧光素酶(RLuc)虽不影响肿瘤细胞体外增殖，但在免疫健全小鼠中引发强烈适应性免疫反应(CD4⁺/CD8⁺T 细胞激活)，导致肿瘤无法形成;叩甲绿荧光素酶(CBG)免疫原性极低，稳定表达后不影响肿瘤细胞体外增殖、体内成瘤及肿瘤免疫微环境组成，且可通过双报告基因(CBG-GFP)实现多模态、多场景无创成像。研究强调，肿瘤免疫研究中需优先评估报告基因的免疫原性，CBG-GFP 是免疫健全小鼠模型的理想选择，为精准研究肿瘤 - 免疫相互作用及评估免疫治疗疗效提供可靠工具。