疫苗开发新突破！小分子 634 诱导钙内流，增强免疫刺激型 EV 释放

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Identification of a Novel Small Molecule That Enhances the Release of Extracellular Vesicles with Immunostimulatory Potency via Induction of Calcium Influx

中文标题：新型小分子化合物 634 通过诱导钙内流增强免疫刺激型胞外囊泡释放

发表期刊：《ACS Chemical Biology》

影响因子：3.8

作者单位：

1. Moores Cancer Center, University of California San Diego, La Jolla, California 92093-0809, United States

2. Department of Rheumatology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University (TMDU), Tokyo 113-8519, Japan

3. The Herbert Wertheim School of Public Health and Longevity, University of California San Diego, La Jolla, California 92093-0901, United States

作者信息：

Yukiya Sako¹, Fumi Sato-Kaneko¹, Nikunj M. Shukla¹, Shiyin Yao¹, Masiel M. Belsuzarri¹, Michael Chan¹, Tetsuya Saito¹,², Fitzgerald S. Lao¹, Helen Kong¹, Marina Puffer¹, Karen Messer³, Minya Pu³, Howard B. Cottam¹, Dennis A. Carson¹,* and Tomoko Hayashi¹,*

研究背景

胞外囊泡(EVs)作为细胞间通讯载体，可携带抗原和免疫调节分子，是疫苗开发的潜在平台，但现有增强 EV 释放的工具(如离子霉素)存在体内毒性。细胞内钙内流与 EV 分泌及免疫细胞活化密切相关，且无毒小分子诱导钙内流可能成为增强免疫刺激型 EV 释放的理想策略。本研究从 28K 化合物库中筛选出新型小分子 634，通过诱导钙内流增强树突状细胞(DCs)释放具有免疫刺激活性的 EVs，为 EV 基疫苗研发提供新工具。

研究方法

本研究经机构动物伦理委员会批准，从 BALB/c 小鼠骨髓分离培养骨髓来源树突状细胞(mBMDCs)，通过三重高通量筛选(HTS)从 28K 化合物库中筛选 EV 释放增强剂，结合钙内流检测鉴定出化合物 634;采用 Fura-2/Fura-8 荧光探针检测 634 诱导 mBMDCs 钙内流的能力及 SOCE 抑制剂(BTP2、AnCoA4)的阻断作用;差速超速离心法分离 EVs，通过微流体电阻脉冲传感(MRPS)检测 EV 数量和大小，透射电镜观察形态，免疫印迹验证 EV 标志物(CD81、Alix);流式细胞术检测 mBMDCs 及 EVs 表面共刺激分子(CD80、CD86、MHC II)表达;CFSE 标记 DO11.10 小鼠 CD4⁺T 细胞，结合 OVA₃₂₃₋₃₃₉肽段检测 EVs 诱导 T 细胞增殖的能力;合成 12 种 634 类似物，进行构效关系(SAR)分析，验证钙内流与 EV 免疫刺激活性的关联性。

实验结果

图1：化合物 634 诱导 mBMDCs 钙内流

该图证实 634 的钙内流诱导作用：在 THP-1 细胞中，634 诱导的钙内流水平显著高于对照组，仅次于阳性对照离子霉素(ION)(图 1A);在 mBMDCs 中，634 可快速诱导钙内流，而类似物 456 无此活性(图 1B);钙回补实验显示，634 先诱导内质网钙释放，再通过 SOCE 介导胞外钙内流，且该过程可被 SOCE 抑制剂 BTP2 阻断(图 1C)，表明 634 通过 Orai1 介导的 SOCE 途径升高细胞内钙水平。

图2：化合物 634 增强 mBMDCs 的 EV 释放

该图显示 634 对 EV 释放的促进作用：MRPS 检测表明，634 处理使 mBMDCs 释放的 EV 数量较对照组增加 45%(图 2A);EVs 主要为小于 200 nm 的小囊泡，大小分布与对照组无显著差异(图 2B);免疫印迹证实 EVs 富集 CD81、Alix 等标志物，几乎不含非 EV 相关蛋白钙联蛋白(图 2C);透射电镜显示 634 诱导的 EVs 形态与对照组一致(图 2D)，且蛋白污染水平相当(图 2E)，符合 MISEV2018 标准。

图3：化合物 634 提升 mBMDCs 及 EVs 表面共刺激分子表达

该图验证免疫刺激分子表达增强：634 处理可显著上调 mBMDCs 表面 CD80、CD86、MHC II 和 CD40 的表达，与阳性对照 MPLA、ION 效果相当(图 3A);BTP2 可阻断 634 介导的共刺激分子上调(图 3B);单颗粒流式和免疫印迹显示，634 诱导的 EVs(EV₆₃₄)表面 CD86、CD80 和 MHC II 表达显著高于对照组 EVs(图 3C-D)，且与母细胞表达模式一致。

图4：EV₆₃₄促进抗原特异性 T 细胞增殖

该图证实 EV₆₃₄的免疫激活功能：在 OVA₃₂₃₋₃₃₉肽段存在时，EV₆₃₄可显著诱导 DO11.10 小鼠 CD4⁺T 细胞增殖，效果与 EV_MPLA、EV_ION 相当，无抗原或无 EV 时无增殖反应(图 4B-C);中和 CD80/CD86 抗体可完全阻断 EV₆₃₄诱导的 T 细胞增殖(图 4D);即使 EV 数量相等，EV₆₃₄诱导的增殖水平仍高于对照组(图 4E)，表明其数量增加和单个 EV 功能增强共同促进免疫激活。

图 5：化合物 634 的构效关系(SAR)分析

该图展示 634 类似物的设计策略：通过修饰 634 的酯基位点，合成 12 种类似物，包括不同链长的烷基酯、支链烷基酯、芳香酯及酰胺、羧酸、N - 甲基磺酰胺衍生物(图 5)，用于验证功能基团对钙内流及 EV 活性的影响。

图6：钙内流与 EV 免疫刺激活性的相关性

该图明确钙内流的关键作用：3 种类似物(2E241、2F186、2H013)丧失钙内流诱导能力，其余 9 种类似物保留该活性(图 6A);钙内流水平与 CD63 荧光素酶报告活性(EV 释放指标)及 CD86 表达水平呈显著正相关(图 6B-C);钙内流阳性类似物诱导的 EVs 对 T 细胞增殖的促进作用显著强于钙内流阴性类似物(图 6D)，证实酯基和磺酰胺基是维持钙内流及 EV 免疫活性的关键基团。

研究结论

本研究成功鉴定出新型小分子化合物 634，其通过 SOCE 途径诱导 mBMDCs 钙内流，显著增强免疫刺激型 EV 释放：不仅增加 EV 数量，还上调 EV 及母细胞表面 CD80、CD86 等共刺激分子表达，进而高效促进抗原特异性 T 细胞增殖，且该过程依赖 EV 表面 CD80/CD86 与 T 细胞的相互作用。SAR 分析进一步证实，钙内流是 634 增强 EV 免疫活性的核心机制，酯基和磺酰胺基是关键功能基团。634 无明显细胞毒性，相比传统钙离子载体更适合体内应用，为 EV 基疫苗开发、免疫调节研究提供了新型工具，有望推动疫苗免疫原性提升策略的发展。