人类胆盐转运体 NTCP 结构新发现：闭合构象是惰性状态，面板域移动调控通道开关

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Structure of nanobody-inhibited state of human bile salt transporter NTCP

中文标题：纳米抗体抑制状态下人类胆盐转运体 NTCP 的结构解析

发表期刊：《Structure》

影响因子：4.3

作者单位：

1. Institute of Molecular Biology and Biophysics, ETH Zürich, 8093 Zürich, Switzerland

2. Department of Biochemistry, Center for Biophysics and Quantitative Biology, Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, USA

作者信息：

Daniel Yoon¹,³, Kamil Nosol¹,³, Ali Rasouli²,³, Rose Bang-Sørensen¹, Rossitza N. Irobalieva¹, Hongtao Liu¹, Emad Tajkhorshid²,, Kaspar P. Locher¹,⁴

研究背景

钠 - 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP，SLC10A1)是肝细胞基底膜上的钠依赖性胆盐转运体，负责胆盐的肝脏摄取与肠肝循环，同时是乙肝病毒(HBV)和丁肝病毒(HDV)的细胞受体，具有重要生理和临床意义。尽管已有 NTCP 的结构报道，但关于其转运机制仍存在争议(如是否需要闭合构象参与运输循环)。本研究通过筛选靶向 NTCP 的 alpaca 纳米抗体(NTCP_Nb1)，解析其抑制状态下的高分辨率冷冻电镜结构，并结合微秒级分子动力学(MD)模拟，揭示 NTCP 的闭合构象特征、钠离子结合模式及功能调控机制，为理解胆盐转运和病毒感染提供结构基础。

研究方法

纳米抗体筛选与表征：用脂质体重组的人 NTCP 免疫 alpaca，通过噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体 NTCP_Nb1，经 CDR 移植优化为 NTCP_Nb1G;采用 ELISA 检测结合亲和力，[³H]- 牛磺胆酸(TC)摄取实验验证其对 NTCP 转运功能的抑制作用。

冷冻电镜样品制备与数据收集：将 NTCP 重组到纳米圆盘中，与 NTCP_Nb1G 及 NabFab 形成三元复合物，添加甘氨鹅脱氧胆酸(GCDC)后制备冷冻电镜样品;使用 Titan Krios G3i 电镜收集数据，经 Relion 4.0 处理获得 3.1 Å 分辨率的密度图，进行模型构建与精修。

分子动力学(MD)模拟：构建 NTCP 闭合构象、开放构象(PDB:7ZYI)、去底物开放构象等 4 种模型，在膜环境中进行 3 μs MD 模拟，分析蛋白稳定性、钠离子与底物的动态变化。

功能验证：通过钠结合位点突变分析、底物结合模式预测，结合相互作用指纹图谱量化配体 - 蛋白相互作用。

实验结果

图1：纳米抗体 NTCP_Nb1 的功能表征

该图证实纳米抗体的结合与抑制活性：NTCP_Nb1 通过 CDR 区域与 NTCP 特异性结合，对去垢剂溶解的 NTCP 的 EC₅₀为 11.0±1.6 nM，对细胞表面 NTCP 的 EC₅₀为 101.4±26.7 nM(图 1B);[³H]-TC 摄取实验显示，NTCP_Nb1 以剂量依赖方式抑制 NTCP 功能，IC₅₀为 1.2±0.2 μM(图 1C)，而对照抗体 NTCP_Fab12 无抑制作用，表明 NTCP_Nb1 是功能性抑制剂。

图2：NTCP-NTCP_Nb1G-NabFab 复合物的冷冻电镜结构

该图展示核心结构特征：NTCP_Nb1G 结合于 NTCP 的细胞外表面，覆盖 ECL1-4 区域，结合表位面积达 867 Ų(图 2B-C);NTCP 呈现闭合通道构象，核心域(TM2-4、TM7-9)与面板域(TM1、TM5-6)紧密作用，细胞外侧的转运通道关闭(图 2A);密度图中明确观察到两个钠离子(Na₁、Na₂b)结合于核心域的交叉基序附近(图 2A 紫色球体)。

图3：NTCP 闭合构象与开放构象的结构对比

该图揭示构象差异：闭合构象中，面板域的 TM1、TM5-6 向核心域刚性移动，阻塞底物结合位点，无法容纳胆盐分子(图 3A-B);开放构象(PDB:7ZYI)的通道开放，可结合两个胆盐分子(S_in、S_out);核心域叠加的 RMSD 为 0.80 Å，差异主要集中在面板域与胞外环(ECL2-3)(图 3C-D)，表明面板域的移动是通道开关的关键。

图4：钠离子结合位点的鉴定

该图明确钠离子结合模式：Na₁位点由 S105、N106 等残基的氧原子配位，与开放构象的 Na₁位点完全一致;Na₂b 位点由 Q68、T258 等残基配位，而开放构象中该位置为水分子，另一个钠离子(Na₂a)位于胞外侧 4.9 Å 处(图 4A-B);Q68 和 Q261 在两个位点中均参与配位，突变后会废除转运功能，提示其在钠离子转运中的关键作用。

图5：MD 模拟揭示构象稳定性与动态变化

该图分析动态特征：闭合构象在模拟中稳定性高，骨架 RMSD<2 Å，两个钠离子持续结合于原位，膜脂质分子插入通道疏水区域稳定构象(图 5A);开放构象中钠离子波动较大(RMSD 2-9 Å)，底物 GCDC 可在通道内移动，S_out 位点的 GCDC 可迁移至 S_in 位点(图 5B-D);去底物开放构象未转变为闭合构象，提示通道闭合需特定触发信号(图 5C)。

图6：NTCP 的构象状态与转运机制示意图

该图总结核心机制：NTCP 存在三种功能状态 —— 本研究发现的惰性闭合状态(无底物结合，含 Na₁、Na₂b)、活性开放状态(结合底物与 Na₁、Na₂a)、药物 / 病毒抑制状态(如 bulevirtide 结合);闭合构象因通道关闭无法转运底物，且不参与活性运输循环，推测其为运输间隙的惰性状态，面板域的构象变化是激活的关键。

研究结论

本研究首次解析了人类 NTCP 在纳米抗体抑制下的 3.1 Å 高分辨率闭合通道结构，明确其结合两个钠离子的模式，揭示了面板域介导的通道开关机制。MD 模拟证实闭合构象是稳定的惰性状态，而非活性运输循环的必需步骤;纳米抗体通过锁定面板域的闭合构象抑制转运功能，为设计 NTCP 靶向抑制剂提供了结构模板。该发现不仅澄清了 NTCP 的转运机制争议，还为 HBV/HDV 感染、胆盐代谢异常相关疾病的治疗提供了新靶点。