HNSCC PDOs的基因组和单细胞分析助力个体化治疗

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种起源于口腔、咽喉和喉部黏膜的恶性肿瘤，占头颈部癌症的90%以上。其发病率因地区而异，与烟草、酒精和人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。由于大多数患者在诊断时已处于晚期，多模式治疗(包括手术、化疗和放疗)成为主要治疗手段。顺铂是常用的化疗药物，免疫检查点抑制剂也被批准用于不可切除、转移或复发性HNSCC的治疗。然而，总体反应率仍然较低，超过一半的患者在两年内因疾病进展和治疗耐药而死亡。因此，迫切需要深入了解HNSCC的病理生理学，以改善患者的医疗护理和临床管理。

2025年4月22日，发表在Cancer Research上题为Genomic and Single-Cell Analyses Characterize Patient-Derived Tumor Organoids to Enable Personalized Therapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma的研究通过建立患者来源的肿瘤类器官(PDOs)，深入分析其在组织病理学、药物反应性和基因组稳定性方面的表现。

PDOs能够模拟原始肿瘤的三维结构，忠实地维持患者特异性的基因组改变和基因表达程序，并可在体外长期培养。与患者来源的肿瘤异种移植物(PDX)模型相比，PDO培养的成功率更高，且表现出与原始肿瘤的形态学和组织学相似性。然而，目前仍不清楚PDOs在多大程度上能够模拟亲本肿瘤的特性，以及长期培养对其生物学和基因组稳定性的影响。此外，HNSCC的高度肿瘤内异质性需要通过单细胞转录组分析来进一步揭示。本研究通过多组学、单细胞基因组和功能分析，系统地解决了这些问题，为HNSCC的精准治疗提供了新的思路和潜在靶点。

图示描述

1，类器官模型的建立与特性分析。研究团队从31例HNSCC患者(2例HPV阳性和29例HPV阴性)的手术样本中建立了患者源性肿瘤类器官(PDO)模型。通过测试三种不同的培养基，优化了每个PDO系的生长条件，最终获得约70%的成功率，建立了22条PDO系，包括一名患者的原发肿瘤和匹配的淋巴结转移灶各一条。这些PDO模型可长期培养(>10代)并能从冷冻保存中恢复和扩增。组织病理学分析表明，PDO保留了原发肿瘤的组织病理学特征，主要表现为三种组织学模式：(1)围绕角质珠的分层鳞状上皮细胞，类似于高分化鳞状细胞癌;(2)基底样、ΔNp63+癌细胞密集填充，类似于中度或低分化鳞状细胞癌;(3)内部有角质珠但周围鳞状上皮细胞排列紊乱，这种形态特征仅见于同时具有TP53/CDKN2A和NOTCH1突变的HNSCC类器官。

2，类器官的异种移植与药物反应性。为评估HNSCC PDO的致瘤性，研究者将PDO细胞注射到免疫缺陷小鼠的两侧皮下。两个选定的PDO系(PDO-04和PDO-06)在小鼠中成功生长，移植的PDO异种移植物(PDOX)与原发肿瘤和PDO表现出高度相似的组织学和标志物蛋白染色模式。总共测试了17条PDO系，其中8条成功生长为PDOX，成功率为47%。随后评估了PDO对顺铂的敏感性，并将其与接受顺铂治疗的匹配HNSCC患者的临床结果相关联。令人惊讶的是，PDO的药物敏感性与匹配患者的临床结果密切相关：PDO对顺铂耐药的患者的无病生存期显著低于PDO对顺铂敏感的患者。这表明HNSCC PDO能够预测患者对顺铂为基础的标准治疗的临床反应。

3，基因组和转录组学分析。通过全外显子组测序(WES)对13组"三联体"样本(早期和晚期传代PDO以及匹配的肿瘤样本)进行基因组分析，结果显示PDO高度保留了原发肿瘤的突变谱。PDO中检测到HNSCC常见的驱动基因突变，如TP53(62%)、CDKN2A(27%)、FAT1(31%)、PIK3CA(15%)、NOTCH1(15%)等。原发肿瘤与早期传代PDO的突变谱平均重叠率为76%，早期与晚期传代PDO的重叠率为87%，表明PDO能长期保持基因组稳定性。拷贝数变异(CNA)分析发现了HNSCC原发肿瘤中常见的染色体区域丢失(3p和8p)和获得(3q、5p和8q)，以及CDKN2A、NSD1、SMAD4的缺失和TP63、SOX2、PIK3CA、CCND1、EGFR、MYC的扩增。总体而言，亲本肿瘤与匹配的早期传代PDO系，以及早期与晚期传代PDO系之间的CNA谱显示出高度相似性。

4，单细胞分析与肿瘤内异质性。研究团队对8个HPV阴性PDO进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，共获得68,919个细胞。细胞类型注释确认这些PDO几乎完全由鳞状上皮细胞组成。UMAP图显示这些类器官肿瘤细胞主要按患者特异性聚类，这可能是由患者特异性的基因组驱动因素所致。通过GSVA方法确定的单细胞RNA-seq分子亚型与相匹配样本的批量RNA-seq高度一致。为解析PDO的肿瘤内转录异质性(ITH)，研究者采用非负矩阵分解(NMF)方法识别了8个共识基因程序，被注释为MYC、G2/M细胞周期、分泌、缺氧、上皮衰老(EpiSen)和混合上皮-间质转化(hEMT)程序。这些ITH程序与已发表的HNSCC、食管SCC(ESCC)和宫颈SCC(CSCC)原发肿瘤的scRNA-seq数据显著相似，表明PDO能忠实地模拟体内患者肿瘤样本的肿瘤内表达异质性模式。

5，hEMT程序与顺铂耐药性。研究者发现，不同PDO系的hEMT阳性细胞比例差异显著，从PDO-51的4.36%到PDO-49的97.4%不等。在比较顺铂敏感和耐药PDO组时，发现只有hEMT程序在两组间表现出统计学显著差异，耐药组的hEMT程序得分更高。皮尔逊相关分析显示，hEMT程序得分(R=0.9，P=0.0022)和hEMT阳性细胞比例(R=0.91，P=0.0019)与PDO的IC50值显著相关。进一步分析TCGA HNSCC队列发现，hEMT高表达肿瘤的患者总体生存率显著低于hEMT低表达肿瘤的患者，多变量分析证实hEMT程序得分是HNSCC患者的独立预后因子。

6，AREG调控hEMT程序和顺铂敏感性。研究者特别关注AREG基因，它在与顺铂IC50的表达相关性排名中位列第二。AREG编码一种生长因子(amphiregulin)，作为EGFR的低亲和力配体，是HNSCC肿瘤的关键可药靶驱动因子。AREG在HNSCC肿瘤中较邻近非恶性样本明显上调，并与HNSCC患者生存率显著相关。功能实验证实，通过独立的siRNA或shRNA敲低AREG增强了HNSCC细胞和PDO对顺铂的敏感性;相反，添加重组AREG蛋白使PDO对顺铂产生耐药性。蛋白质实验表明，沉默AREG降低了EGFR信号通路下游靶标AKT和ERK的磷酸化水平。AREG与多个hEMT程序基因表达高度相关，敲低AREG下调了hEMT程序基因的表达水平，而添加重组AREG蛋白促进了EGFR磷酸化和hEMT基因的表达。体内异种移植实验进一步验证了AREG在顺铂耐药中的作用：AREG沉默的SNU-1066和PDO-06异种移植肿瘤对顺铂治疗更敏感，而对照肿瘤几乎不响应顺铂治疗。

全文总结

本研究成功构建HNSCC患者源性肿瘤类器官(PDO)模型，证实其能维持原发肿瘤的组织病理学与基因组特征，且长期培养下特性稳定。PDO可预测患者对顺铂治疗的反应，体外药物敏感性与预后紧密相关。批量与单细胞RNA测序揭示PDO分子亚型及肿瘤内异质性，与患者肿瘤高度相似。研究还发现混合型上皮-间质转化(hEMT)程序与顺铂耐药及不良预后相关，AREG为关键调控因子，通过激活EGFR通路促进耐药。