从酸性到碱性都发光！PLR 凝聚层改写萤火虫生物发光特性

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Alteration in the Sensitivity of Firefly Bioluminescence to pH Driven by Molecular Recruitment to Coacervate Droplets

中文标题：凝聚层液滴中分子募集驱动萤火虫生物发光的 pH 敏感性变化

发表期刊：《ACS Omega》

影响因子：4.3

作者单位：

1. Faculty of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki 305-8573, Japan

2. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan

3. Japan Science and Technology Agency (JST), PREST, Kawaguchi, Saitama 332-0012, Japan

作者信息：

Yoshiki Kihara, Shunsuke Tomita, Kazuki Niwa, Ryoji Kurita*, and Ryo Nishihara*

研究背景

萤火虫生物发光(BL)因高选择性和发光效率，广泛用于药物研发、基础医学的无创光学成像(BLI)，但其一发光特性(强度、颜色、量子产率 φBL)对 pH 极其敏感 —— 酸性条件下发射色从黄绿变红、φBL 显著下降，可能导致细胞内成像结果误读。细胞内无膜细胞器(MLOs)通过液 - 液相分离(LLPS)调控生化反应，而由生物分子形成的凝聚层(coacervates)是 MLOs 的理想体外模型。此前研究发现，精氨酸(PLR)或赖氨酸(PLL)同型肽与 ATP 形成的凝聚层可浓缩萤火虫荧光素酶(Fluc)及其底物 D - 荧光素(LH₂)，提升 φBL 和反应动力学，但 pH 对该体系生物发光 pH 敏感性的调控机制尚未明确。本研究以 PLR/ATP 和 PLL/ATP 两种凝聚层为对象，在 pH 5.1-10.0 范围内探究其对萤火虫 BL 的 pH 依赖性影响，揭示凝聚层调控 BL 特性的分子机制，为细胞内 MLOs 存在时的 BLI 结果解读及新型生物传感器开发提供依据。

研究方法

试剂与储备液制备：

所用试剂包括 ATP(东京化成)、D - 荧光素、MgCl₂(和光纯药)、萤火虫 Fluc(Sigma-Aldrich)、PLR/PLL(Alamanda Polymers)等;储备液按特定浓度配制，如 30μM Fluc 溶于含 10% 甘油的 50mM GTA 缓冲液(pH7.4)，25mM D - 荧光素溶于 DMSO，后续通过 50-150mM GTA 缓冲液调节 pH 至 5.1-10.0;Fluc 浓度通过 280nm 吸光度(NanoDrop)测定。

BL 强度与基础特性检测：

384 孔板中混合反应体系(1.875mM ATP、5nM Fluc、1.95-250μM D - 荧光素、5.63mM 同型肽单体、50mM GTA 缓冲液)，室温孵育 3-15min 后，加 10μL 5mM MgCl₂启动 BL 反应，酶标仪(Spark Cyto)测 60s BL 强度;600nm 吸光度检测体系浊度，验证凝聚层形成稳定性。

动力学与抑制剂实验：

动力学参数(Kₘ、Vₘₐₓ)通过 Michaelis-Menten 方程拟合不同 D - 荧光素浓度下的 30s BL 强度获得;抑制剂实验中，在 pH8 条件下加入 0.0125-125μM 脱水荧光素(BL 反应副产物)，拟合剂量 - 响应曲线计算 IC₅₀，t 检验比较缓冲液与凝聚层体系差异;BL 光谱通过 LumiFL SpectroCapture 在 370-700nm 范围捕获，设定 180s 检测时间、0.5mm 狭缝宽度。

成像与量子产率测定：

显微镜成像(Spark Cyto)捕获含 Alexa680 标记 Fluc 的体系明场及荧光图像(绿色通道检测 LH₂荧光，远红通道检测 Fluc);BL 量子产率(φBL)通过自定义发光仪(Hamamatsu H11890-01 光电倍增管)测定，校准后检测反应完全时的总光子数，计算 φBL 并考虑 10% 测量不确定度。

实验结果

图1：凝聚层与萤火虫 BL 系统示意图

图 1a 展示 ATP(负电)与同型肽(PLR/PLL，正电)的化学结构，明确静电作用为 LLPS 的主要驱动力;图 1b 对比无凝聚层(缓冲液体系)与有凝聚层(同型肽体系)的 BL 系统，显示凝聚层对 Fluc 和 LH₂的浓缩作用;图 1c 为 BL 反应 scheme，即 D - 荧光素(LH₂)在 Fluc、ATP、Mg²⁺作用下转化为氧化荧光素(oxyLH₂)并释放光信号，明确反应核心过程。

图2：Fluc与LH₂在凝聚层中共定位及浓缩证实

Fluc 与 LH₂在凝聚层中的定位明场图像显示，pH 5.5-9.0 范围内，PLR/ATP 和 PLL/ATP 体系均形成直径约 25μm 的球形凝聚层，且随时间逐渐融合(图 2b、c);荧光成像(Fluc 标记 Alexa680 为红色，LH₂自身荧光为绿色)显示，所有 pH 条件下，Fluc 与 LH₂均共定位在凝聚层内部，而缓冲液体系中无明显聚集(图 2a)，证实凝聚层对 BL 反应组分的有效浓缩。

图3：凝聚层对 BL 强度与颜色的 pH 依赖性影响

图 3a 显示，缓冲液和凝聚层体系的 BL 强度均在 pH7.4 达最大值，但 PLR 凝聚层在 pH6.4-9.5、PLL 凝聚层在 pH7.0-9.5 的 BL 强度显著高于缓冲液，且 PLR 体系在 pH6.0-9.0 的强度优于 PLL;

图 3c 光谱显示，缓冲液和 PLL 体系在 pH6.4-8.0 呈黄绿色(565nm)到红色(615nm)的 pH 依赖性变色，而 PLR 体系在 pH5.5-7.0 即呈黄绿色;

图 3d 的 565/615nm 强度比拐点 pH 显示，PLR 体系(6.40)低于缓冲液(7.12)和 PLL 体系(7.05)，证实 PLR 凝聚层显著改变 BL 的 pH 颜色敏感性。

图4：凝聚层对 BL 动力学参数的影响

图 4a 显示，pH6.4-9.0 范围内，两种凝聚层的 Vₘₐₓ(最大反应速率)均高于缓冲液，且 PLR 体系 Vₘₐₓ始终高于 PLL，与 BL 强度趋势一致;图 4b 显示，Kₘ(底物 - 酶亲和力指标)呈 “缓冲液 < PLL

图5：凝聚层对 BL 反应抑制剂的影响

图 5a 明确 BL 反应副产物(脱水荧光素、oxyLH₂)为 LH₂的竞争性抑制剂;

图 5b 显示，PLR 凝聚层对脱水荧光素的 IC₅₀显著高于缓冲液;图 5c 显示 PLL 凝聚层对 oxyLH₂的 IC₅₀更高(p<0.05)，证实 PLR 通过结合脱水荧光素、PLL 通过结合 oxyLH₂，分别降低两种抑制剂对 Fluc 的抑制作用，从而提升 Vₘₐₓ。

图6：pH5.5-9.0凝聚层提升BL量子产率且与颜色无关

凝聚层对 BL 量子产率(φBL)的影响pH5.5-9.0 范围内，凝聚层体系的 φBL 均高于缓冲液，且在 pH6.4-9.0 提升显著：缓冲液在 pH8.0 达最大 φBL(36.4%)，而 pH9.0 时仅 3.9%;PLL 凝聚层在 pH9.0 的 φBL 达 35.8%，PLR 达 17.4%;且凝聚层体系中 φBL 与发光颜色无显著关联(如 pH6.4 时 PLR 与 PLL 的 565/615nm 比值不同，但 φBL 相近)，说明 φBL 提升是 BL 强度增强的另一核心因素，与颜色无关。

研究结论

本研究证实，精氨酸 / 赖氨酸同型肽与 ATP 形成的凝聚层(PLR/ATP、PLL/ATP)可通过两种机制调控萤火虫生物发光的 pH 敏感性：一是通过浓缩 Fluc 和 LH₂，在 pH6.4-9.5 范围内提升 Vₘₐₓ(减少反应产物抑制)和 φBL，增强 BL 强度;二是 PLR 凝聚层通过改变内部微环境 pH，使 BL 在酸性条件下仍保持黄绿色发射，显著偏移 pH 颜色依赖性拐点。该发现不仅为细胞内无膜细胞器存在时的生物发光成像结果解读提供关键依据，也为开发 pH 稳健型生物传感器(如 intracellular pH 检测、靶向 MLOs 的成像工具)提供新策略。