建立双向潜能人肺类器官培养系统及产生成熟肺泡和气道类器官的分化方法

随着干细胞技术的发展，科学家们能够在实验室环境中生成被称为类器官的微型器官或"盘中器官"。类器官是来源于干细胞的三维培养物，它们模拟体内相应组织或器官的结构和功能。这些类器官已成为模拟发育生物学、生理学和病理学的有力工具。人类呼吸道由两种不同类型的上皮组成：气道和肺泡上皮，科学家们从肺组织中建立了长期可扩增的ASC衍生的人肺类器官。他们进一步开发了近端分化方案，生成在形态和功能上近似生理水平模拟气道上皮的三维和二维气道类器官。然而，从肺类器官衍生肺泡上皮(由I型和II型肺泡上皮细胞组成)的方法尚未明确。

近期，香港大学周婕等在Bio - protocol期刊上发表了题为Establishing Bipotential Human Lung Organoid Culture System and Differentiation to Generate Mature Alveolar and Airway Organoids的研究论文，该研究建立了一个双向潜能肺类器官培养系统，能够通过远端分化产生肺泡类器官或通过近端分化产生气道类器官。肺类器官作为长期扩增的稳定来源，而分化的气道和肺泡类器官忠实地模仿人类气道和肺泡上皮。这些类器官是强大且具有生理活性的工具，适用于各种实验操作，探索人类肺的生物学和病理学。

图示描述

1，肺类器官的建立与扩增：研究团队成功从新鲜切除的肺组织中提取细胞，通过胶原酶消化、机械剪切和基质胶包埋等步骤建立了肺类器官培养。肺类器官在扩增培养基中生长，该培养基含有多种生长因子和抑制剂，如Rspondin1、Noggin、FGF-7、FGF-10等。这些类器官可以连续传代超过一年(约16-24次传代)，表现出高稳定性。免疫荧光染色显示，扩增状态的肺类器官含有不同类型的呼吸道上皮细胞，包括P63阳性的基底细胞、FOXJ1/ACCTUB阳性的纤毛细胞、MUC5AC阳性的杯状细胞、CC10阳性的俱乐部细胞以及SFTPB阳性的II型肺泡上皮细胞。

2，肺泡类器官的远端分化：为了诱导肺类器官向肺泡方向分化，研究者将单细胞悬液在远端分化培养基(DD培养基)中进行悬浮培养10-14天。DD培养基含有地塞米松、8-溴-cAMP、IBMX以及WNT信号激活剂(WNT3A或CHIR99021)等成分。经过分化后，肺泡类器官形成具有腔体和薄壁的三维结构。免疫荧光染色证实这些类器官包含AQP5阳性的I型肺泡上皮细胞和SFTPB/HTII-280阳性的II型肺泡上皮细胞。功能测试使用β-BODIPY FL C12-HPC和LysoTracker染色，展示了II型肺泡上皮细胞的表面活性剂代谢功能。

图1 试验示意图

3，气道类器官的近端分化：研究者开发了一种优化的二维气道类器官生成方法，通过在Transwell插入物中培养肺类器官衍生的单细胞。先在扩增培养基中培养2天，再更换为pH 7.4的近端分化培养基(PD培养基)2天，最后在上室使用pH 6.6的PD培养基、下室使用pH 7.4的PD培养基继续培养10天。PD培养基包含PneumaCult-ALI培养基及补充物、肝素、氢化可的松和DAPT等成分。约7天后，类器官中出现可见的运动纤毛。免疫荧光染色确认了ACCTUB阳性的纤毛细胞存在，电子显微镜观察显示了纤毛的超微结构。

4，双向分化潜能的验证：研究证实，同一来源的肺类器官既可以向肺泡方向分化，也可以向气道方向分化，展示了其双向潜能特性。这是首个能够实现呼吸道上皮细胞长期扩增和双向分化的两阶段类器官培养系统。扩增培养的肺类器官提供了稳定、可再生的呼吸道上皮细胞来源，而分化后的肺泡和气道类器官在形态和功能上忠实模拟了人类肺泡和气道上皮。

图 2 肺类器官的获取与扩增

5，类器官的表征与功能分析：研究者通过多种方法对类器官进行了全面表征，包括RT-qPCR检测细胞特异性基因表达、免疫荧光染色和流式细胞术分析蛋白表达、电子显微镜观察超微结构、活细胞染色评估功能等。对肺泡类器官，使用β-BODIPY FL C12-HPC和LysoTracker红色染料评估II型肺泡上皮细胞的表面活性剂处理功能;对气道类器官，通过光学显微镜直接观察到纤毛的运动。

6，类器官的应用潜能：研究者指出，这些有机体培养系统可应用于多种研究，包括呼吸道病毒感染研究、疾病建模、药物筛选和临床前测试。作为人类呼吸道上皮的生理活性体外模型，肺类器官及其分化产物为探索人类肺的生物学和病理学提供了独特平台。此外，类器官可以冷冻保存用于长期储存和生物样本库建设，也可以替代传统的动物模型用于药物开发和疾病研究。

图 3 优化的二维气道类器官的生成

全文总结

该研究成功建立了一个从人类肺组织衍生的双向潜能类器官培养系统，这一系统能够长期扩增并定向分化成肺泡或气道类器官。该研究在呼吸系统生物学和疾病研究领域具有重大意义。首先，该研究为人类呼吸道上皮的全面体外重建提供了有力工具。其次，这一类器官系统提供了前所未有的模拟人类呼吸道上皮的近似生理水平体外模型。第三，该系统为药物开发和疾病研究提供了更可靠的平台。第四，对呼吸道病毒感染研究具有特殊价值。最后，这一双向分化系统的建立为个体化医疗奠定了基础。总之，这一研究提供的双向潜能肺类器官培养系统代表了呼吸道上皮研究领域的重要进展，为呼吸系统生物学研究、疾病模型建立、药物开发和个体化医疗提供了强大工具。