开发合成组织器建立人源神经管类器官的背腹轴分化模式

神经管(NT)的背腹(D-V)分化对中枢神经系统(CNS)的发育和功能至关重要。在胚胎发育过程中，BMP和SHH两种形态发生素分别从神经管的顶板(RP)和底板(FP)扩散，形成沿D-V轴的反向梯度。神经祖细胞感知并解读这些梯度信号，分化成不同亚型，形成神经管的精确D-V模式。这一过程最终导致20多种不同类型神经元的产生，构成高度组织化的神经回路，使生物体能够感知环境并产生运动行为。然而，由于伦理限制和缺乏合适的模型，人类神经管发育及其相关疾病的研究一直受到限制。

2025年5月7日，浙江大学徐鹏飞团队发表在Cell Stem Cell上题为Establishing dorsal-ventral patterning in human neural tube organoids with synthetic organizers的研究开发了一种名为“ORDER”(源自多能干细胞聚集体融合的组织器)的方法，通过在神经外胚层细胞聚集体内构建对立的BMP和SHH信号中心，成功生成了具有明确背腹模式的神经管类器官(NTOs)。该方法不仅适用于斑马鱼，还成功应用于人类多能干细胞(hPSCs)，生成的人类NTOs(hNTOs)在细胞组成和空间排列上与人类胚胎脊髓高度相似，转录组分析显示其与人类胚胎脊髓的相似度高于小鼠模型。此外，研究还揭示了WNT信号在hNTOs中介导中间神经祖细胞身份的关键作用，并利用hNTOs模型模拟了TCTN2相关D-V分化缺陷，提出了潜在的修复策略。

图示描述

1，构建具有背腹分化的斑马鱼神经管类器官(zNTOs)。研究团队首先使用斑马鱼胚胎体(zEB)培养系统测试了他们的ORDER策略。他们选择斑马鱼胚胎的动物极区域细胞，使用BMP抑制剂LDN193189处理以诱导神经/表皮外胚层命运。随后，通过分别过表达bmp2b和shha mRNA生成两个信号中心，并将它们融合在预处理的神经外胚层聚集体的相对两端。通过杂交链反应(HCR)共染色确认BMP和SHH信号的活性梯度在zNTOs中呈现相反的分布。使用表达msx1a、pbx1b、olig2和nkx2.2b(分别标记神经管背侧、中间和腹侧区域)的荧光转基因斑马鱼系，研究人员观察到zNTOs展现出与胚胎神经管相似的背腹模式，验证了ORDER方法的有效性。

2，利用hPSCs构建和发育具有背腹分化的人源神经管类器官(hNTOs)。为将ORDER方法应用于人类细胞，研究团队生成了两种可诱导的hPSC细胞系，分别表达BMP4和SHH。他们从野生型hPSCs形成神经外胚层聚集体，并将iBMP4和iSHH聚集体融合在神经外胚层聚集体的两端。通过添加DOX触发BMP4和SHH表达，成功建立了hNTOs。通过原位杂交和免疫荧光染色，研究人员证实了hNTOs中MSX1、PAX3、DBX2、OLIG2、NKX2.2和FOXA2等标志物的有序排列，精确反映了胚胎神经管的背腹模式。进一步分析证明，hNTOs主要表达HOXB4(前脊髓标志物)，明确了其沿前后轴的定位。通过降低细胞数量减小hNTO尺寸后，研究者观察到中央腔的形成和顶-基底极性的建立，表现出假层状上皮特性。

3，hNTOs的细胞组成和组织特征分析。通过单细胞RNA测序，研究团队在hNTOs中鉴定出四类主要细胞群体：表皮(表达BMP4和KRT8)、神经元(表达STMN2和ONECUT2)、神经嵴细胞(表达TFAP2B和SOX10)和神经祖细胞(表达SOX2和SOX3)。深入分析神经祖细胞群体，研究者检测到沿背腹轴分布的全部13种神经管祖细胞亚型，表明hNTOs在UMAP图上精确重现了神经管的背腹组织。通过多种标志物的免疫荧光和HCR共染色，进一步证实了这些细胞群体在空间上的有序排列，包括ZIC1(RP-dp3)、PAX3(RP-dp6)、MSX1(RP-dp1)、SOX10(NC)、OLIG2(pMN)、NKX2.2(p3)、NKX6.1(p2-FP)等背腹轴不同区域的标志物。尤其重要的是，中间神经祖细胞标志物DBX2(dp5-p1)和DBX1(dp6-p0)在背腹轴的中间区域被检测到，其中DBX2表达区域比DBX1更广，这与体内模式一致。

4，hNTOs在转录组水平重现CS12人类脊髓特征。将hNTOs的单细胞RNA测序数据与人类胚胎脊髓(CS12-CS19)的数据比较，线性回归分析表明hNTOs与卡内基12期(CS12)人类脊髓在转录谱上高度相似。UMAP分析显示hNTOs细胞与CS12脊髓细胞聚集在一起，13种神经祖细胞亚型在UMAP图上沿伪背腹轴有序排列。细胞-细胞通讯分析显示神经祖细胞亚型之间存在强烈的相互作用，RP和FP表现出最强的信号发送特征，BMP和SHH信号分别在RP和FP中富集。通过将所有细胞投射到伪背腹轴上，研究者发现13种神经祖细胞亚型的排列顺序与人类胚胎神经管背腹轴上的排列模式高度一致，关键标志基因的表达模式也高度相似。总体而言，这些结果表明ORDER方法生成的hNTOs在细胞类型组成和空间模式上与CS12人类脊髓高度相似。

5，hNTOs中的神经元分化和功能评估及WNT信号在中间祖细胞特化中的作用。延长培养时间后，hNTOs中出现了表达TuJ1的后有丝分裂神经元，免疫荧光染色证实了运动神经元(表达CHAT、ISLET1和HB9)和感觉神经元(表达BRN3A)的形成。微电极阵列(MEA)记录显示hNTOs具有稳健的自发细胞外动作电位信号，证明了类器官的功能性。通过比较小鼠神经管、人类神经管和hNTOs的神经祖细胞转录组，研究发现hNTOs比小鼠神经管更接近人类神经管，特别是在中间祖细胞(p1)的特化方面。基因本体富集分析发现WNT信号在hNTOs和人类神经管中显著富集，但在小鼠神经管中不显著。进一步研究证实，抑制WNT信号会完全消除背侧(MSX1和ZIC1)和中间祖细胞标志物DBX2的表达，而DBX1表达仍然存在，同时腹侧祖细胞命运扩大。这表明WNT信号对人类神经管背侧和中间祖细胞命运的诱导至关重要。

6，hNTOs用于研究人类神经发育疾病的应用。研究团队以TCTN2为例，展示了hNTOs作为疾病模型的应用价值。TCTN2是一种对纤毛功能至关重要的跨膜蛋白，其突变与人类神经系统发育障碍相关。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究者在hNTOs的腹侧组织器(SHH信号中心，vKO)或同时在腹侧组织器和中间聚集体(双敲除，dKO)中敲除TCTN2。多重HCR染色显示腹侧细胞身份(OLIG2、NKX2.2和NKX6.1)在TCTN2 vKO和dKO hNTOs中显著减少，同时背侧区域(ZIC1和PAX6)明显扩大，TCTN2 dKO中的缺陷更为显著。单细胞RNA测序进一步证实了TCTN2缺陷hNTOs中祖细胞亚型比例的改变，SHH信号显著减弱而BMP信号扩大。通过SAG(SHH激活剂)和Tubacin(HDAC6抑制剂)处理，研究者能够部分恢复TCTN2 dKO hNTOs中的背腹分化缺陷，表明hNTOs可用于开发潜在的治疗策略。

全文总结

这项研究为理解神经管背腹分化提供了突破性的体外模型系统。ORDER方法通过精确控制形态素梯度，成功地重建了人类神经管复杂的背腹模式，创建了生理学上相关的类器官模型。与传统方法相比，该研究不仅实现了13种神经祖细胞亚型的重现，还建立了中间祖细胞的形成，这在先前的模型中一直是挑战。

hNTOs与CS12人类脊髓在转录组和空间分布上的高度相似性，为研究人类神经管发育提供了无与伦比的工具。该模型揭示了WNT信号在调控人类中间神经祖细胞身份方面的关键作用，这一作用在之前未被充分认识。此外，通过TCTN2缺陷模型，研究展示了hNTOs用于模拟神经发育疾病和筛选潜在治疗策略的价值。