UBASH3B介导的MRPL12 Y60去磷酸化可抑制肺腺癌发展

代谢重编程是肿瘤发生和发展过程中的关键特征，在肺腺癌(LUAD)的病理生理过程中发挥着重要作用。然而，LUAD中代谢重编程的精确机制和潜在靶点仍不明确。线粒体核糖体蛋白MRPL12作为一种新发现的线粒体转录调节基因，对线粒体代谢具有关键影响。尽管如此，MRPL12在癌症中的转录活性作用和调节机制仍未被充分探索。

近年来，线粒体代谢失调，特别是氧化磷酸化(OXPHOS)的异常，在LUAD肿瘤发生中受到越来越多的关注。研究表明LUAD细胞表现出显著升高的OXPHOS特征，提示其可能依赖OXPHOS来满足能量需求。RNA测序和蛋白质组分析也显示LUAD组织中OXPHOS显著上调。关键的是，OXPHOS已被确立为癌症治疗的可行靶点。然而，LUAD中线粒体OXPHOS的具体调节机制仍不完全清楚，潜在的干预靶点也不明确。

翻译后修饰(PTM)在调节癌蛋白的生理功能方面发挥着关键作用，这些修饰通过改变蛋白质活性、稳定性和相互作用，已被证实参与各种癌症的肿瘤发生过程。值得注意的是，靶向调节PTMs在各种肿瘤干预中具有重要的临床意义。例如，靶向特定蛋白磷酸化的小分子抑制剂可以选择性地调节其生理功能，从而阻碍肿瘤生长或诱导癌细胞凋亡。

近期，山东第一医科大学附属山东省立医院刘毅等在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research期刊上发表了题为UBASH3B‑mediated MRPL12 Y60 dephosphorylation inhibits LUAD development by driving mitochondrial metabolism reprogramming的研究论文，研究揭示了线粒体转录调节因子MRPL12在驱动LUAD肿瘤发生中的重要作用机制，强调了线粒体OXPHOS在LUAD代谢中的独特地位。与传统的Warburg效应不同，本研究突出了增强的线粒体OXPHOS是LUAD代谢的显著特征，干扰MRPL12 Y60磷酸化以破坏线粒体代谢可作为LUAD的有前景的干预策略。

图示描述

1，MRPL12在LUAD中高表达并与不良预后相关。通过构建Tp53f/f;KrasG12D;MRPL12f/f(KPM)小鼠模型，研究发现MRPL12缺失显著抑制了Tp53-/-;KrasG12D小鼠肺部肿瘤的发展并延长了生存期。组织芯片分析显示MRPL12在LUAD组织中的表达显著高于正常肺组织，临床LUAD组织也表现出比癌旁组织更高的MRPL12表达。通过构建人源LUAD患者来源类器官(PDO)，证实了MRPL12的高表达，并通过HE染色和CK7免疫染色验证。TCGA数据库分析表明，LUAD组织中MRPL12的mRNA和蛋白水平均升高，高MRPL12表达与晚期病理分期(III和IV期)以及更高的T、M、N分期显著相关，并与患者不良预后密切相关。

图1 实验示意图

2，MRPL12促进LUAD肿瘤发生的体内外功能验证。通过构建稳定的MRPL12过表达和敲低细胞系，发现MRPL12敲低显著抑制了A549和H1299细胞的非贴壁依赖性和贴壁依赖性增殖，而MRPL12过表达则增强了LUAD细胞增殖。使用CRISPR/Cas9技术敲除MRPL12显著抑制了LUAD细胞增殖，重新过表达MRPL12恢复了增殖表型。在PDO模型中，MRPL12敲低限制了PDO生长，而过表达促进了类器官形成。异种移植实验显示，MRPL12敲低导致肿瘤生长显著减少，肿瘤体积和重量均明显降低，Ki67表达也显著减少。Transwell迁移和侵袭实验表明，MRPL12敲低显著抑制了细胞迁移和侵袭能力，而过表达则促进了这些过程。

3，MRPL12通过促进线粒体氧化磷酸化调节肿瘤发生。研究发现MRPL12过表达或敲低导致A549和H1299细胞中mtDNA拷贝数增加或减少。在PDO中，MRPL12影响线粒体编码的氧化呼吸链复合物相关基因(如ND1、CYTB和MTCO2)的表达水平。异种移植组织和KrasG12D小鼠模型中也观察到MRPL12敲低或过表达后MTCO2和ND1表达的相应变化。功能评估使用Seahorse XFe96细胞外通量分析仪显示，MRPL12过表达显著增强了备用呼吸能力、基础和最大呼吸能力以及与ATP合成偶联的OCR，而MRPL12敲低产生相反效果。结构照明超分辨率显微镜(SIM)和电子显微镜观察显示，MRPL12敲低诱导线粒体结构损伤，包括肿胀、排列不规则、嵴结构不清晰以及体积和丰度减少。重要的是，当暴露于线粒体有氧呼吸抑制剂时，MRPL12过表达在LUAD细胞中诱导的增殖、迁移和侵袭效应被有效抑制。

图 2 在 Tp53−/−;KrasG12D/+ 小鼠中，MRPL12 的肺特异性敲除可抑制肺肿瘤发生

4，UBASH3B与MRPL12相互作用并调节其磷酸化。通过免疫共沉淀和质谱分析，鉴定出UBASH3B作为MRPL12的特异性结合蛋白。分子对接分析显示MRPL12和UBASH3B基于其兼容的蛋白质空间结构可以形成稳定的复合物。IP实验证实了这种相互作用，免疫荧光染色显示了MRPL12和UBASH3B的共定位。邻近连接实验(PLA)进一步证实了MRPL12和UBASH3B之间的相互作用。通过Co-IP实验确定MRPL12的45-90氨基酸片段与UBASH3B相互作用，而UBASH3B的SH3结构域是与MRPL12结合的关键区域。研究发现UBASH3B作为酪氨酸磷酸酶，可以调节MRPL12的磷酸化水平，过表达或敲低UBASH3B会使磷酸化MRPL12水平降低或升高。通过生物信息学分析鉴定出MRPL12的两个酪氨酸磷酸化位点Y60和Y152，突变实验证实Y60是MRPL12的主要酪氨酸磷酸化位点。

5，MRPL12 Y60去磷酸化通过影响与POLRMT结合调节线粒体功能。MRPL12 Y60A突变体(模拟Y60去磷酸化)未能诱导线粒体编码基因(如CYTB、MTCO2和ND1)的表达，也无法上调mtDNA拷贝数。Seahorse分析显示，MRPL12过表达显著增加了基础氧消耗率(OCR)、ATP偶联OCR、最大呼吸和备用呼吸能力，而MRPL12 Y60A突变体缺乏增强线粒体OXPHOS的能力。电子显微镜观察显示，敲除MRPL12导致线粒体肿胀、线粒体嵴减少和结构紊乱，MRPL12野生型过表达部分恢复了线粒体形态，但MRPL12 Y60A过表达并未显著改善线粒体结构和形态。Co-IP实验表明，MRPL12 Y60A突变体减弱了内源性MRPL12与POLRMT之间的相互作用，而UBASH3B过表达也削弱了MRPL12与POLRMT的结合。功能实验证实，MRPL12野生型过表达增强了细胞增殖、迁移、侵袭和跨内皮细胞迁移能力，而MRPL12 Y60A突变体过表达失去了促进LUAD细胞恶性表型的能力。

图 3 MRPL12 在肺腺癌类器官、组织和细胞中过表达，且与不良生存相关

6，MRPL12 Y60磷酸化在体内模型和临床样本中的验证。异种移植实验显示，MRPL12野生型过表达组的肿瘤大小和重量显著大于对照组，而MRPL12 Y60A过表达组与对照组相比没有显著变化。IHC结果表明，MRPL12野生型过表达上调了MTCO2、ND1和Ki67的表达，而MRPL12 Y60A突变体过表达对这些基因表达无显著影响。MRPL12野生型过表达显著促进了A549细胞的肺转移，而MRPL12 Y60A突变体过表达未显著增强肺转移能力。在PDO模型中验证显示，MRPL12 Y60A突变体失去了促进PDO形成的能力，也未能显著增加MTCO2、ND1和CYTB的表达。开发的MRPL12 Y60磷酸化特异性抗体显示，LUAD肿瘤组织中MRPL12 Y60磷酸化水平高于邻近组织。

图 4 MRPL12 促进肺腺癌肿瘤发生

全文总结

该研究确立了MRPL12作为LUAD中的新型致癌基因，通过协调线粒体代谢重编程向氧化磷酸化方向发展来促进LUAD病理发生。研究发现了MRPL12的关键磷酸化修饰位点Y60，并阐明了其在调节MRPL12致癌功能中的特异性作用，为开发LUAD特异性靶向药物和临床干预提供了重要见解。研究发现的UBASH3B-MRPL12-POLRMT调节轴为理解线粒体生物合成调节提供了新的分子机制，MRPL12 Y60磷酸化作为关键修饰影响MRPL12的生物学功能和LUAD发展，有望成为疾病的治疗靶点。这些发现为设计靶向MRPL12 Y60位点的小分子化合物抑制MRPL12磷酸化提供了理论基础，代表了LUAD潜在的干预策略。