用于增强类器官培养的生物反应器技术

类器官作为能够重现天然组织部分结构和功能的三维细胞组织体，近年来在组织发育研究、药物发现和潜在临床应用中获得了显著地位。与传统的单层细胞培养相比，类器官在基因和蛋白质表达、细胞极化以及宏观和微观组织结构方面都表现出与天然组织更高的相似性。然而，体外成功培养类器官的要求与传统单层细胞培养显著不同。高保真类器官的生成和成熟需要开发和优化环境条件，以提供生长和三维成熟的最佳信号，如氧合、机械和流体激活、营养梯度等。

静态培养作为组织培养的"金标准"，无法准确重现体内环境的许多方面，包括营养可用性、气体交换、基质特性、废物清除等。动态生物反应器有助于克服静态培养的许多局限性，允许研究人员模拟二维培养中未发现的许多环境特征，如增加的流体流动、信号分子和生长因子的梯度以及各种类型的刺激。传统生物反应器通常是用于促进生物过程的大型储罐，而用于类器官培养的生物反应器通常较小，使用少至几毫升的培养基。由于细胞培养基和补充剂的高成本，大多数研究旨在限制生物反应器的规模。

近期，发表在International Journal of Molecular Sciences期刊上一篇题为Bioreactor Technologies for Enhanced Organoid Culture的研究论文全面评述了用于类器官培养的四种主要生物反应器技术，为该领域的发展提供了重要的理论指导和实践参考。

图示描述

1，搅拌式生物反应器的应用与优势。搅拌式生物反应器(SBRs)在类器官培养中显示出多项优势，主要源于改善的传质和增强的氧合。研究表明，培养基搅拌可以减少氧化应激，提高细胞存活率并加速分化。在三维组织培养中，超过1毫米直径的细胞球体经常出现缺氧、坏死的核心，周围环绕着薄薄的(约100微米)活细胞环。Lancaster等人通过使用SBRs改善氧气可用性和营养吸收，成功生成了比静态条件下培养的更大、更连续的复杂脑类器官。Schneeberger等人利用旋转瓶培养肝脏类器官，结果显示旋转瓶培养始终导致肝细胞标记物(CYP3A4、ALB、MRP2)的上调和干细胞标记物(LRG5)的下调，mRNA测序显示与肝功能和成熟相关的基因上调多达四倍。

图1 用于组织体培养的常用生物反应器

2，微流控生物反应器的精确控制能力。微流控生物反应器(MFBs)提供了对微环境参数的精确调节能力，这对于敏感的类器官培养特别重要。Zhang等人开发了一个模块化传感MFB平台，集成了物理、生化和光学传感器，用于肝脏和心脏类器官培养。该系统包括电化学微电极传感器阵列，可检测抗体-抗原结合时氧化还原探针的电子转移活性，以及集成的迷你显微镜用于实时形态学成像。Wang等人使用配备可灌注微柱阵列的MFB维持hiPSC衍生的肝脏类器官长期培养，结果显示灌注培养条件下类器官的细胞活力显著提高，与静态培养相比，caspase 3阳性染色的细胞死亡显著减少(约12%降至更低水平)。

图 2 类器官在转瓶中分化为功能性肝细胞。类器官在转瓶中或静态对照条件下分化 12 天

3，旋转壁容器的低剪切环境。旋转壁容器(RWVs)通过圆形或圆柱形容器的旋转创造低剪切混合和模拟微重力环境。研究表明，与旋转瓶培养相比，在RWV中培养细胞时重组蛋白产量增加了七倍。DiStefano等人使用HARV型RWV培养视网膜类器官，结果显示RWV中的类器官生长显著更快，成熟更早，在第25天显示出的成熟水平直到第32天才在对照组中看到，缩短了一周的必要培养时间。RNA-seq转录组分析确认，在RWV中维持的类器官中的基因表达模式与更早时间点的体内视网膜相匹配。作者假设增强的氧气、营养和废物交换导致了更快的生长和成熟。

图 3 利用简易三维可灌注芯片系统由人诱导多能干细胞(hiPSCs)原位生成肝类器官的示意图，以及在该芯片系统中 hiPSCs 向肝类器官分化的表征

4，电刺激生物反应器的分化促进作用。电刺激(ES)生物反应器主要用于可电兴奋组织的分化和成熟，特别是神经组织和肌肉组织。Eng等人使用定制的生物反应器对心脏胚胎体进行电刺激，使用5 V/cm振幅和2毫秒脉冲，频率为0.5、1或2 Hz。结果显示ES导致心脏基因表达和细胞-细胞连接的增加，随着频率增加，类器官表现出更高频率的跳动适应性。Zhang等人设计了叉指电极系统刺激皮质脑类器官，对野生型和神经调节蛋白1敲除(NRG1-KO)神经类器官进行ES。暴露于ES导致神经突数量和长度的改善，并增加了突触发生标记物NCAM和PSD95的表达，显示ES能够挽救表型并促进功能失调神经元的发育。

图 4 不同培养条件下类器官的生长情况

5，各类生物反应器的局限性与挑战。尽管各类生物反应器具有显著优势，但也存在相应的局限性。SBRs的高流体剪切力和叶轮不稳定性可能对剪切敏感的类器官培养造成损害。MFBs面临制造复杂、成本高昂、操作困难和维持无菌性等挑战，软光刻成型过程需要洁净室和专业设备。RWVs需要相对较高的用户技能，细胞接种和培养基更换需要特别小心以避免将气泡引入容器，计算建模显示RWV内气泡的存在会产生相对于周围环境显著升高的剪切力局部区域。ES生物反应器主要限制在于只适用于可电兴奋的组织类型，对于某些细胞和组织类型可能产生不利影响。

全文总结

生物反应器技术的应用显著改善了类器官培养的多个方面，包括存活、分化和成熟，解决了类器官培养中固有的问题，如为大型三维组织构建物充分维持氧气和营养可用性。这些技术进步使类器官更接近成功应用于移植、药物发现和个性化医疗等临床应用。未来的研究方向应关注组合生物反应器的开发，如配备电极的微流控设备，以及机械压缩/张力刺激生物反应器的开发，以进一步提高类器官培养的质量和一致性。