患者来源的子宫内膜癌类器官的构建与维持

子宫内膜癌(EC)是美国女性妇科恶性肿瘤发病率和死亡率的主要原因，在癌症研究取得进展的同时，子宫内膜癌的死亡率仍在上升，特别是高级别子宫内膜癌。子宫内膜癌是美国第四大常见癌症和第六大癌症死亡原因，是少数几种发病率和死亡率都在快速上升的癌症之一。预计到2040年，它将成为第三大最常见癌症和第四大癌症死亡原因，超过肺癌和结直肠癌。此外，子宫内膜癌还存在显著的种族差异问题，在所有癌症中黑人与白人患者5年相对生存率差异最大(63% vs. 84%)，这些令人担忧的趋势突出了研究子宫内膜癌分子和细胞基础的迫切需要。

传统的永生化2D细胞系和小鼠模型在子宫内膜癌研究中应用广泛，但它们不能提供可靠的模型。2D细胞培养系统缺乏原代子宫内膜组织固有的关键3D结构，影响了受微环境和定向影响的腺体细胞功能。同样，小鼠模型也不能准确代表人类子宫内膜的生物学特性，这突出了需要能够模拟人类子宫内膜癌生物学的可靠生物学模型的必要性。患者来源类器官(PDOs)作为3D结构，能够精确复制子宫内膜组织的微环境和细胞组成，为研究特定组织学和分子亚型的子宫内膜癌提供了临床相关模型。

发表在Bio - protocol期刊上一篇题为Generation and Maintenance of Patient-Derived Endometrial Cancer Organoids的研究论文建立并优化了患者来源的子宫内膜癌类器官培养体系，可长期扩增并精确复现不同亚型EC的组织学和分子特征，为研究肿瘤发生、进展及个性化治疗提供了临床相关的体外模型。

图示描述

1) 类器官培养体系的建立与优化：研究团队成功建立了针对子宫内膜癌和正常子宫内膜组织的患者来源类器官培养体系。该体系包括两种不同的培养基配方：人肿瘤子宫内膜类器官培养基和人正常子宫内膜类器官培养基。两种培养基的主要成分包括Advanced DMEM/F12、GlutaMAX、HEPES、R-Spondin条件培养基、B27补充剂、N2补充剂等多种生长因子和小分子化合物。关键的差异在于R-Spondin条件培养基的浓度(肿瘤类器官为10%，正常类器官为15%)以及特定生长因子的组合。培养基可在4°C保存最多10天，为实验操作提供了便利。

2) 组织处理与类器官生成流程：从接受子宫切除术的子宫内膜癌患者获得新鲜的肿瘤和正常子宫内膜组织标本，经过机构审查委员会批准并获得患者知情同意。组织标本在手术后立即运输到实验室，如果不能当天处理则在4°C过夜保存。组织处理流程包括：首先用PBS清洗组织并切成1mm碎片，然后用含有胶原酶IV和Y-27632的RPMI培养基在37°C消化1-1.5小时，期间每15-30分钟剧烈摇动。消化完成后，用TrypLE进一步处理最多15分钟，目标是获得小的类器官团块而不是单细胞。最后将细胞重悬于70%Matrigel和30%培养基的混合物中，以每微升100个细胞的密度接种到6孔板中。

图1 患者来源样本中子宫内膜癌及正常类器官制备的示意图概述

3) 类器官的传代与维持：建立的类器官可以通过多个传代进行扩增，维持其生物学特性。传代过程包括：使用细胞刮刀刮取Matrigel凝胶，用Corning细胞回收溶液(CRS)收集类器官，在冰上孵育1小时直至类器官沉淀。随后用TrypLE和Y-27632处理细胞团块，在37°C孵育10分钟，通过轻柔吹打分离类器官至合适大小。分离后的类器官重新悬浮于75%Matrigel和25%培养基的混合物中，接种到新的培养板中。研究显示，正常和肿瘤类器官在生长速度和需求方面存在显著差异，需要在不同时间点进行个体化管理。

4) 类器官的冷冻保存与复苏：为了建立可持续的细胞资源，研究建立了类器官的冷冻保存和复苏流程。冷冻过程中，类器官在CRS或基质溶解溶液中收集，离心后用500μL冻存培养基重悬，储存在液氮中。复苏时，将冷冻管在37°C水浴中温热1分钟，加入等体积培养基稀释，离心后重新悬浮于Matrigel和培养基混合物中进行培养。这种方法确保了类器官的长期保存和后续实验使用的可行性。

图 2 源自正常子宫内膜和癌组织的患者源性类器官

5) 类器官表型验证与应用：研究成功建立了来自正常子宫内膜、FIGO1级(低级别)、FIGO2级(中级别)、FIGO3级(高级别)、浆液性癌和癌肉瘤的患者来源类器官，证明所有组织学亚型都可以被培养并通过多个传代维持。浆液性癌类器官在传代1(P1)、传代7(P7)和传代14(P14)中显示出良好的存活和维持能力。这些类器官准确复制了各种组织学和分子亚型的子宫内膜癌特征，为研究子宫内膜癌的发展、转移、进展和复发提供了临床相关的平台，并为开发针对特定子宫内膜癌亚型的靶向治疗干预措施提供了潜在机会。

6) RNA提取与定量分析方法：研究还建立了针对不同细胞密度类器官的RNA提取方法。对于低产量(50细胞/μL)的类器官，直接在培养孔中加入Trizol试剂进行裂解;对于正常产量(100细胞/μL)的类器官，先用CRS收集类器官，然后用Trizol处理。类器官定量采用台盼蓝染色结合自动细胞计数器进行。这些标准化的分析方法为后续的分子生物学研究和药物筛选实验提供了技术支持。

全文总结

该研究建立的患者来源子宫内膜癌类器官培养体系具有重要的科学意义和临床应用价值。首先，该体系克服了传统2D细胞培养和动物模型的局限性，提供了更准确反映人类子宫内膜癌生物学复杂性的3D模型。其次，成功培养涵盖各种组织学亚型的类器官，特别是那些影响少数族裔人群的罕见且侵袭性更强的亚型，为研究种族差异和开发个体化治疗策略奠定了基础。第三，类器官的长期维持和冷冻保存能力解决了组织样本限制的问题，为持续研究提供了可持续的细胞资源。最后，该平台为药物筛选、肿瘤行为研究和治疗反应评估提供了强有力的工具，有望促进更有效和个体化的新型治疗策略的发展，最终改善子宫内膜癌患者的临床结局。