揭示 HAMA-SBMA水凝胶递送软骨类器官促进软骨再生研究

骨关节炎是一种慢性退行性关节疾病，影响全球超过5亿人口，导致残疾和生活质量下降。关节软骨由于缺乏血管、神经和淋巴系统，组织无法自然愈合，软骨组织修复在临床上仍然是一个挑战。目前的软骨修复方法包括骨软骨自体移植、自体软骨细胞移植和微骨折手术等，但这些方法都存在各自的并发症，如供体部位病变、自体软骨细胞数量不足以及纤维软骨形成等问题。

近年来，干细胞在软骨再生医学领域引起了越来越多的关注。然而，依赖二维培养系统的细胞扩增策略可能导致细胞去分化，因此迫切需要三维细胞培养技术来更好地保存细胞形态、功能和移植物的生物力学完整性。软骨类器官技术能够复制软骨的结构和功能，具有重要前景，但需要维持细胞功能并确保在损伤部位的安全固定。

脱细胞细胞外基质能够克服免疫原性，模拟体内微环境，具有与天然器官和组织相似的机械和生化特性。透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)能够刺激软骨细胞和干细胞增殖，调节炎症反应，增强软骨再生，但HAMA水凝胶硬度高，缺乏粘附性。磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)作为两性离子颗粒水凝胶，具有超亲水性，支持细胞粘附效果更好。

近期，中国人民解放军总医院彭江/汪爱媛、中国医科大学附属第一医院李旭发布在Journal of nanobiotechnology期刊，题为HAMA-SBMA hydrogel with anti-inflammatory properties delivers cartilage organoids, boosting cartilage regeneration的研究认为CEP是培养CO的理想候选材料，而CCO与水凝胶结合用于修复软骨损伤，为软骨再生和组织工程提供了创新性策略和材料选择方案。

图示描述

1) 软骨类器官构建与表征：研究成功制备了猪关节软骨脱细胞细胞外基质微粒(CEP)，通过理化结合方法确保良好的生物相容性。CEP呈准球形，具有"放射状"ECM纤维结构，DNA含量从607.6 ng/mg降至28.50 ng/mg，保留约77.40%的糖胺聚糖和近90%的总胶原。将异体骨髓间充质干细胞负载到CEP上构建软骨类器官(CCO)，显著促进了BMSCs增殖。CCO(D21: 500μm)比单独CO(D21: 300μm)直径更大，到第14天时CCO表现出更高的COL2、ACAN和关节软骨特异性PRG4表达水平，并延缓了软骨肥大过程。

图1 CCO展现出关节软骨的特性并延缓骨化进程

2) 新型水凝胶合成与性能：通过将不同量的SBMA(0、300、600、900、1200mg)掺入50mg HAMA水凝胶中，成功合成了具有粘附特性的新型HS水凝胶。FTIR分析证实了水凝胶的成功交联，HS300、HS600、HS900、HS1200水凝胶在1030-1080 cm⁻¹处显示SBMA特征峰。SEM分析显示HS0、HS300和HS600水凝胶具有良好连通性的多孔结构，孔径从133.4±13.73μm逐渐减小至5.024±2.69μm。粘附强度和剪切强度逐渐增加，杨氏模量从4.15±0.70 MPa降至2.38±0.43 MPa，硬度从0.66±0.14 MPa降至0.13±0.03 MPa。

图2 HS水凝胶的制备与表征

3) 生物相容性与细胞迁移促进：Live/dead染色和CCK-8实验证实所有HS水凝胶组均表现出良好的生物相容性，其中HS600在第3天和第7天显著促进BMSC增殖。细胞划痕实验和Transwell实验表明，所有HS组均增强了BMSCs的横向和垂直迁移能力。免疫荧光分析显示HS300和HS600组促进M1巨噬细胞(iNOS/CD86)向M2型细胞(Arg-1/CD206)转化。SO和AB组织化学染色显示两个水凝胶组积累了更多的GAG，免疫荧光结果表明两个水凝胶组促进了胞质中COL2表达和细胞核中SOX9表达，HS600表现出最强的软骨形成和粘附能力。

图3 HS展现出良好的生物相容性并能促进BMSCs迁移

4) 动物实验验证：在大鼠股骨滑车软骨缺陷模型中，术后8周时HS600+CCO组显示出接近Sham组的修复效果，缺陷组织与周围正常组织边界模糊。Micro-CT结果显示HS600+CCO组软骨下骨表面光滑、平整、连续，无明显塌陷。HE和AB染色结果与宏观观察一致，术后8周软骨组织显示一致的蓝色染色，表明新生软骨中多糖浓度随愈合过程增加。纳米压痕测试显示HS600+CCO组的机械性能在8周时与Sham组相当。在绵羊模型中，术后6个月HS600+CCO组几乎完全填满缺陷，而缺陷组仅显示少量纤维组织。

图4 HS600+CCO组合在大鼠实验中展现出卓越的修复效果

5) 机制研究：转录组分析显示HS600+CCO组上调2443个基因，下调3177个基因，其中软骨保护基因Frzb高表达。GO分析显示生物功能主要与细胞发育过程相关，KEGG通路分析显示在focal adhesion、PI3K-AKT和Wnt信号通路中显著富集。通过构建Frzb过表达质粒和shRNA738敲降实验，证实HS600+CCO通过激活Frzb促进软骨再生。Frzb敲除导致SOX9和COL2表达降低，HS600+CCO激活Frzb促进整合素α5β1表达，同时抑制Wnt和PI3K通路，通过PI3K-AKT抑制减少炎症因子iNOS、COX2和ROS的产生。

图5 HS600+CCO通过激活Frzb促进整合素α5β1表达，同时抑制炎症因子

6) 抗炎效果验证：在绵羊关节液中通过ELISA检测炎症因子，术后3个月HS600+CCO组IL-1β表达显著降低，IL-10表达显著增加。6个月时HS600+CCO组显著抑制IL-1β、IL-6、COX2和TNF-α，同时IL-10表达显著降低，表明HS600结合CCO能够抑制早期炎症反应并促进抗炎因子产生。

全文总结

本研究成功构建了具有关节软骨特征的软骨类器官复合材料，并合成了具有粘附特性、促进软骨形成和抑制炎症的新型HS水凝胶。该组合治疗策略在大鼠和绵羊股骨滑车缺陷模型中均表现出强劲的软骨修复效果。机制研究揭示HS+CCO主要通过激活软骨保护基因Frzb来促进关节软骨再生，为软骨再生和组织工程提供了创新的策略和材料选择，展现了广阔的临床应用潜力，为未来软骨类器官的临床应用奠定了坚实基础。