联合使用IOs和IOEVs可治疗IBD相关骨质疏松症

炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，全球影响约600-800万人，其特征为慢性、进行性和复发性，显著降低患者生活质量，常伴发骨质疏松症(OP)。目前假说认为IBD的病因归因于遗传易感个体对微生物群的免疫反应失调，但潜在的发病机制仍不清楚。IBD患者体内炎症因子水平升高，促进破骨细胞活性，抑制成骨细胞分化，导致骨量丢失。

现有IBD治疗策略包括非特异性治疗和靶向干预，尽管生物制剂有效，但高达30%的患者初始无反应，另有50%的患者随时间产生耐药性。因此，深入理解肠道免疫系统机制和IBD免疫发病机制对开发新型免疫治疗方法至关重要。

肠道类器官(IOs)技术为IBD研究和治疗策略提供新见解。这些干细胞衍生的类器官具有三维结构，在体外准确模拟肠道组织的生理和病理生理过程，可用于疾病建模、药物筛选和阐明宿主-微生物相互作用。类器官具有再生特性，可作为受损肠道组织的细胞和组织来源。此外，胞外囊泡(EVs)是细胞间生物分子释放和转移的重要载体，类器官来源的胞外囊泡(IOEVs)在调节和治疗肠道炎症性疾病方面显示出积极效果，其治疗潜力扩展到包括免疫疾病和骨质疏松症在内的多种疾病。

近期，上海大学转化医学研究院苏佳灿/刘晗/高洁，上海交通大学医学院附属新华医院何崇儒联合发布在Journal of orthopaedic translation期刊，题为Combination therapy using intestinal organoids and their extracellular vesicles for inflammatory bowel disease complicated with osteoporosis的研究结果表明，联合使用IOs和IOEVs为治疗IBD相关骨质疏松症提供了一种潜在的治疗方法。

研究结果

1，肠道类器官培养与表征

研究成功建立了小鼠小肠类器官培养体系。光学显微镜观察显示，第1天类器官主要由松散排列的小细胞团构成;第3天，细胞排列更加致密，形成更明确的组织结构;第5天，细胞层进一步增厚，细胞间连接更加紧密，呈现类似腺样结构的细胞形态;第7天，类器官持续生长，细胞层继续增厚，腺样结构进一步发育，呈现更复杂成熟的形态。透射电子显微镜观察显示，小鼠类器官由细胞膜包裹的囊泡组成，含有肠上皮细胞、帕内特细胞、杯状细胞、隐窝干细胞、成纤维细胞等多种细胞类型，细胞内含有丰富的线粒体、高尔基体、内质网等细胞器。

图1 类器官提取与培养

2，IOEVs分离表征与miRNA分析

通过差速离心法成功分离IOEVs，透射电镜显示IOEVs具有典型的细胞膜包围结构，直径在胞外囊泡特征尺寸范围内，表面光滑。纳米颗粒跟踪分析显示IOEVs浓度范围为1.23×10¹⁰-9.61×10¹⁰颗粒/mL，平均粒径约136.8nm，ζ电位约-13.4mV。CCK-8检测显示IOs和IOEVs具有良好的生物相容性。miRNA测序分析发现IOEVs中富含与IBD治疗相关的miRNA，包括miR-23a-3p、miR-93-5p、miR-186-5p、let-7b-5p和let-7c-5p。GO和KEGG分析显示这些miRNA参与核苷酸结合、ATP结合、蛋白质结合、细胞分化、凋亡过程、脂质代谢和免疫调节等生物学过程。

图2 miRNA在IOEVs中的表达谱分析

3，体外IBD模型治疗效果

建立LPS诱导的体外IBD类器官模型，荧光显微镜观察显示IBD组类器官结构紊乱，失去原有完整性，而IOs或IOEVs处理后形态明显恢复。PI和Hoechst染色评估细胞凋亡和坏死情况，对照组凋亡和坏死最少，IBD组细胞死亡广泛，IOs或IOEVs处理组细胞活力部分恢复，IOs+IOEVs联合治疗组几乎完全消除凋亡和坏死。流式细胞术分析显示IBD组凋亡和坏死率约47.28%，IOs、IOEVs和IOs+IOEVs组分别降至27.74%、7.32%和5.38%。碱性磷酸酶实验证实IOEVs在LPS诱导的细胞炎症状态下具有显著的成骨效应。

图3 建立IBD体外模型并分析生存状态

4，小鼠IBD模型体内治疗验证

建立DSS诱导的小鼠IBD模型，体重监测显示正常组小鼠体重略有增加，IBD组体重持续下降，IOEVs治疗后体重下降约32.57%，IOs+IOEVs组体重逐渐恢复约13.88%。结肠长度检查显示DSS处理后结肠长度缩短2-3cm，表面略显粗糙，IOs和IOEVs治疗后结肠长度增加，形态改善。H&E和PAS染色显示DSS处理的IBD组呈现大量炎症相关组织损伤，包括细胞浸润、粘膜糜烂和炎症反应加剧，IOs+IOEVs组治疗后损伤程度缓解，炎症减轻，组织结构部分恢复。安全性评估显示心、肝、脾、肺、肾等器官无显著病理改变。

图4 验证IBD小鼠治疗的有效性

5，炎症相关蛋白表达分析

免疫荧光染色分析显示，紧密连接蛋白ZO-1在IBD组表达降低，提示屏障功能受损;凋亡介质Caspase-3在IBD组活性升高，表明凋亡活性增强;增殖标志物Ki67在IBD组指数增加，反映组织修复反应。IOs+IOEVs组ZO-1上调表明紧密连接修复启动，Caspase-3活性缓解提示凋亡减轻，Ki67指数升高可能表明细胞周转增加。ELISA分析显示与IBD组相比，IOs+IOEVs组TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平降低，但仍高于正常组，而IL-10表达显著高于IBD组和正常组，表明治疗干预可能减轻促炎反应并增强抗炎机制。

图5 体内炎症性肠病模型疾病特异性蛋白表达及炎症反应

6，IBD伴发骨质疏松症治疗

Micro-CT分析显示IBD小鼠骨密度降低，呈现严重骨质疏松症状，IOs和IOEVs治疗的IBD小鼠骨量增加，微结构改善。H&E和马松染色显示IBD小鼠骨小梁显著丢失，IOs+IOEVs治疗大幅缓解。评估股骨远端骨量的关键参数包括骨密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)、骨表面积/总体积(BS/TV)和骨体积分数(BV/TV)，在IOs+IOEVs组均显著升高，表明有效缓解骨质疏松诱导的骨量丢失。IOs和IOEVs单独治疗组虽显示部分骨量改善，但效果明显不如联合治疗组。

图6 体内治疗炎症性肠病相关骨质疏松症

全文总结

本研究建立了利用肠道类器官及其胞外囊泡治疗IBD合并骨质疏松症的新型治疗范式。研究发现IOEVs富含具有抗炎和成骨作用的功能性miRNA，为开发微创、无细胞治疗炎症性疾病系统性并发症提供了理论基础。联合治疗策略不仅能有效缓解肠道炎症，恢复肠道屏障功能，还能逆转IBD相关的骨质疏松进展，为肠-骨轴调节提供了新的治疗思路。该研究为IBD合并骨质疏松症这一临床难题提供了有前景的治疗策略，为未来临床研究奠定了重要基础，具有重要的转化医学价值。