新生大鼠视网膜 Müller 细胞怎么养？标准化 protocol 来了，纯度超 90%！

视网膜 Müller 胶质细胞(RMCs)作为视网膜主要的大胶质细胞，是神经血管单元的核心组分，不仅为视网膜提供结构支持，还参与 neurotransmitter 清除、代谢调节及水离子稳态维持，更被视为内源性视网膜再生干细胞的重要来源，在视网膜退行性疾病治疗中具有潜在价值。然而，目前原代 RMCs 的分离培养方法缺乏标准化，尤其是新生 SD 大鼠来源的 RMCs 培养方案尚未完善。在此背景下，来自成都中医药大学眼科学院及附属中医医院眼科的 Fuwen Zhang 团队(Yunhua Tang 等参与)在《Journal of Visualized Experiments》(2025, 220:e68129)发表研究，系统建立了从 3-5 日龄 SD 大鼠分离、培养原代 RMCs 的标准化 protocol，通过胰酶消化、纯化、形态学观察、特异性标志物鉴定及流式细胞术纯度分析，获得纯度≥90% 的 RMCs，为视网膜疾病基础研究及临床转化提供了可靠的细胞模型。

本研究旨在建立一套高效、标准化的原代视网膜 Müller 细胞(RMCs)分离培养及鉴定方法。以 3-5 日龄 SD 大鼠为研究对象，在无菌条件下摘除眼球，分离视网膜组织，经胰酶消化、离心纯化获得原代 RMCs 并进行培养传代;通过倒置显微镜观察细胞形态，HE 染色分析细胞结构，免疫荧光检测特异性标志物(谷氨酰胺合成酶 GS、细胞视黄醇结合蛋白 CRALBP、波形蛋白 Vimentin、水通道蛋白 AQP4、内向整流钾通道 Kir4.1)，流式细胞术量化细胞纯度。结果显示，分离的 RMCs 呈星状或梭形，高表达特异性标志物，纯度达 90% 以上，且前 3 代细胞状态稳定，适合后续功能研究。该 protocol 为 RMCs 相关研究提供了标准化技术支撑。

研究背景

RMCs 贯穿视网膜全层，通过丰富的离子通道、转运体及酶系统，参与维持视网膜微环境稳态：调节钾离子(Kir4.1)和水分子(AQP4)平衡，清除谷氨酸等神经递质，分泌营养因子。在糖尿病视网膜病变、青光眼等病理状态下，RMCs 功能异常会破坏血 - 视网膜屏障，加剧炎症及视网膜功能损伤;同时，RMCs 作为潜在的再生干细胞，在特定条件下可分化为视网膜神经元，为退行性疾病修复提供新方向。

原代 RMCs 因更贴近体内状态，是研究其生理功能及病理机制的理想模型，但现有培养方法存在操作差异大、细胞纯度低、传代稳定性差等问题。本研究针对新生 SD 大鼠，优化分离培养步骤，建立包含鉴定在内的完整流程，旨在解决上述瓶颈，为 RMCs 相关研究提供可靠技术方案。

实验结果

图 1：P2 代 RMCs 在倒置显微镜下的形态

该图展示不同放大倍数(40×、100×、200×)下第 2 代 RMCs 的形态特征：细胞呈星状或梭形，排列紧密，边缘光滑;细胞核为圆形或椭圆形，大小均一，胞质内可见颗粒状物质，部分细胞伸出放射状突起。这些形态特征符合 RMCs 的典型表型，证实经分离培养后细胞保持正常形态。

图 2：HE 染色显示 RMCs 的细胞结构

该图通过 HE 染色(100×、200×、400×)进一步呈现 RMCs 的结构细节：细胞呈梭形或星状，部分仍为圆形(分化不完全);胞质丰富呈浅粉色，细胞膜清晰;细胞核大而椭圆，居中分布，染色较深(粉或浅红色);细胞边缘光滑，通过纤细的丝状结构相互连接。染色结果从细胞结构层面验证了 RMCs 的特征，支持其纯度及状态良好。

图 3：RMCs 特异性标志物的免疫荧光染色

该图通过免疫荧光检测 RMCs 标志物的表达：GS 和 AQP4 呈明亮红色荧光，CRALBP、Kir4.1 和 Vimentin 呈绿色荧光，细胞核经 DAPI 染色为蓝色;细胞体呈圆形或椭圆形，可见单或双核，胞质丰富，细胞膜边界清晰，突起明显，细胞间连接紧密;阴性对照 NeuN(神经元标志物)无表达。定量分析显示 90% 以上细胞为阳性，从分子层面证实所培养细胞为 RMCs，且纯度较高。

图 4：流式细胞术分析 RMCs 的纯度

该图通过流式细胞术量化 RMCs 纯度：左侧检测 GS 表达，右侧检测 CRALBP 表达;蓝色峰为阴性对照，红色峰为阳性细胞;GS 阳性率达 97.0%，CRALBP 阳性率达 98.7%。结果直接证实经本方法分离培养的 RMCs 纯度≥90%，满足后续功能实验的细胞质量要求。

研究结论

本研究建立了从 3-5 日龄 SD 大鼠分离、培养原代视网膜 Müller 细胞的标准化 protocol，关键步骤包括：无菌条件下眼球摘除与视网膜分离，0.25% 胰酶消化(原代 5 min，传代 1.5 min)，离心纯化，前 3 代细胞培养;通过形态观察、HE 染色、特异性标志物(GS、CRALBP 等)免疫荧光及流式细胞术鉴定，获得纯度≥90% 的 RMCs。该方法操作规范、重复性好，为研究 RMCs 在视网膜疾病中的作用及再生潜力提供了可靠细胞模型。局限性在于细胞传代次数有限(第 4 代后出现衰老死亡)，未来可探索添加营养因子延长细胞存活时间，进一步优化培养体系。