壳聚糖纳米颗粒：激活肿瘤特异性 T 细胞的高效抗原载体

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Chitosan nanoparticles as antigen vehicles to induce effective tumor specific T cell responses

中文标题：壳聚糖纳米颗粒作为抗原载体诱导有效的肿瘤特异性 T 细胞反应

发表期刊：《PLOS ONE》

影响因子：2.6

作者单位：

1. Institute for Experimental Cancer Research, Kiel University and University Medical Center Schleswig-Holstein (UKSH) Campus Kiel, Kiel, Germany

2. Institute of Biochemistry, Kiel University, Kiel, Germany

3. Department of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Kiel University, Kiel, Germany

4. Institute of Immunology, Kiel University and UKSH Campus Kiel, Kiel, Germany

5. Department of Hematology and Oncology, University Medical Center Schleswig-Holstein (UKSH) Campus Kiel, Kiel, Germany

作者信息：

Frederik Walter, Elsa Winter, Sascha Rahn, Judith Heidland, Saskia Meier, Anna-Maria Struzek, Marcus Lettau, Lisa-Marie Philipp, Silje Beckinger, Lilli Otto, Julia Luisa Möller, Ole Helm, Daniela Wesch, Regina Scherließ, Susanne Sebens

研究背景

癌症疫苗通过激活肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞发挥抗肿瘤作用，树突状细胞(DCs)作为最强效的抗原呈递细胞(APCs)，其抗原呈递效率是疫苗成功的关键。壳聚糖纳米颗粒(CNPs)因生物相容性好、具有佐剂活性，被视为理想的抗原载体。本研究以 OVA 衍生肽 SIINFEKL 为模型抗原，探索不同尺寸和质量的 CNPs 作为抗原载体的潜力：评估其被 APCs摄取的效率、对细胞活力的影响、诱导 DCs 的表型变化、抗原呈递能力，以及最终激活肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞并介导胰腺导管腺癌(PDAC)细胞裂解的效果，为 PDAC 的免疫治疗提供新策略。

研究方法

通过离子凝胶法制备三种不同分子量(90/10、90/20、90/50，DDA 均为 90%)的 FITC 标记壳聚糖纳米颗粒(CNPs)，表征其粒径、多分散指数(PDI)，并负载模型抗原 SIINFEKL;培养 murine DC2.4 细胞、人原代 DCs、M1/M2 巨噬细胞及 PDAC 细胞系(Panc02、Panc-OVA)，将 APCs 与 100μg/ml CNPs 共孵育 24 小时，通过成像细胞术和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测摄取效率，Caspase-3/7 活性 assay 和 PI 染色评估细胞活力;从 OT-1 小鼠脾脏分离 CD8⁺ T 细胞，与经 CNPs 处理的 DC2.4 细胞共培养 72 小时，通过流式细胞术检测 T 细胞活化标志物(CD25、CD44、CD69)，计数活细胞评估扩增能力;将活化的 T 细胞与 Panc02/Panc-OVA 共培养，通过细胞汇合度分析评估肿瘤杀伤效果;同时采用 RT-qPCR 检测细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α 等)mRNA 水平，流式细胞术分析 MHC-I 抗原呈递(H-2Kb-SIINFEKL 复合物)。

实验结果

图1：不同抗原呈递细胞(APCs)对 CNPs 的摄取

成像细胞术显示，人原代 DCs、murine DC2.4 细胞及 M1/M2 巨噬细胞均可摄取三种尺寸的 CNPs，其中最大尺寸的 90/50-CNPs 摄取率最高(60-70%);

DCs 对小尺寸 90/10-CNPs 的摄取率高于巨噬细胞;在与 H441 肺上皮细胞共培养时，DCs 的 CNPs 摄取率(65-74%)显著高于上皮细胞(38-46%)。

结果表明 CNPs 可被 APCs 高效摄取，且 DCs 是更优的靶向细胞。

图2：大尺寸 CNPs 对 APCs 的毒性

Caspase-3/7 活性检测显示，90/50-CNPs 处理的 DCs 凋亡活性是对照组的 5 倍，显著高于 90/10-CNPs(1.5 倍);

M1/M2 巨噬细胞经任何尺寸 CNPs 处理后凋亡活性均升高 3 倍以上;

DCs 的细胞汇合度随 CNPs 尺寸增大而降低，90/50-CNPs 组 PI⁺细胞面积显著增加。

结果证实大尺寸 CNPs(90/50)对 APCs 毒性显著，小尺寸 90/10-CNPs 对 DCs 安全性更高。

图3：CNPs 诱导 DCs 的促炎表型

人原代 DCs 和 DC2.4 细胞经 SIINFEKL 负载的 90/10-CNPs 处理后，促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)mRNA 水平显著升高，且高于空 CNPs 组;抗炎症因子(TGF-β1、IL-10)无明显变化;DCs 表面共刺激分子(CD80、CD86)和 HLA-DR 表达无显著差异。结果表明负载抗原的 CNPs 可诱导 DCs 呈现促炎表型，利于 T 细胞激活。

图4：负载抗原的 CNPs 激活 CD8⁺ OT-1 T 细胞

DC2.4 细胞经 90/10-SIINFEKL-CNPs 处理 5 小时后，表面 H-2Kb-SIINFEKL 复合物表达达峰;与 CD8⁺ OT-1 T 细胞共培养后，T 细胞活细胞数显著增加，激活标志物 CD25、CD44、CD69 阳性率升高，形成更大的细胞簇，效果与游离 SIINFEKL 相当。结果证实 CNPs 可通过 DCs 有效激活肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞。

图5：活化的 CD8⁺ T 细胞特异性杀伤肿瘤细胞

经 90/10-SIINFEKL-CNPs 处理的 DCs 激活的 CD8⁺ T 细胞，可使表达 SIINFEKL 的 Panc-OVA 细胞汇合度降至对照组的 0.21 倍，显著低于未表达抗原的 Panc02 细胞(0.73 倍);空 CNPs 组无明显杀伤效果。结果表明该体系可诱导抗原特异性肿瘤细胞裂解。

研究结论

壳聚糖纳米颗粒(CNPs)尤其是小尺寸 90/10 型，可被树突状细胞(DCs)高效摄取，且对 DCs 毒性低;负载模型抗原 SIINFEKL 的 90/10-CNPs 能诱导 DCs 呈现促炎表型，促进 MHC-I 抗原呈递，进而激活并扩增肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞，最终介导表达该抗原的胰腺导管腺癌细胞(PDAC)特异性裂解。本研究证实 CNPs 是高效的抗原载体，为开发针对 PDAC 等低免疫原性肿瘤的疫苗提供了实验依据。