基因诱导的内皮细胞生态位实现人类肾类器官的血管化、多系成熟和肾素表达细胞的出现

在器官再生医学的研究中，类器官技术近年来取得了重大进展。类器官是通过体外培养的干细胞形成的三维细胞团，能够模拟体内器官的结构和功能。这种技术在研究疾病机制、药物筛选和再生治疗中具有广泛应用。然而，大多数类器官在结构和功能上仍然与体内器官存在显著差距，尤其是缺乏血管网络的支持，这极大地限制了它们的成熟度和功能性。

肾脏类器官(Human Kidney Organoids，HKOs)在再生医学中有着重要的应用前景。肾脏是一个高度血管化的器官，其功能依赖于复杂的血管网络。缺乏血管化的类器官难以模拟真实的肾脏环境，这不仅限制了其在研究中的应用，也影响了它们在药物筛选和再生医学中的有效性。

为了克服这一难题，研究人员采用基因工程技术，将ETS易位变体2(ETV2)基因引入诱导多能干细胞(iPSCs)，从而诱导这些细胞分化为内皮细胞。ETV2是一个关键的转录因子，能够促进内皮细胞的分化。通过将这种基因诱导的iPSCs(iETV2-hiPSCs)与非转基因iPSCs结合，研究人员成功地在肾类器官中建立了一个内皮细胞生态位。这一创新方法不仅改善了类器官的血管化，还促进了肾单位结构的成熟和功能性肾素表达细胞的出现。相关研究结果以题为A genetically inducible endothelial niche enables vascularization of human kidney organoids with multilineage maturation and emergence of renin expressing cells发表在Kidney international期刊。

研究结果

图1：展示了iETV2-hiPSCs在体外诱导形成内皮细胞的过程

图1a：开发的四环素诱导的ETV2-EGFP hiPSC系在单层细胞培养中的免疫荧光图像。24小时四环素暴露后，ETV2-EGFP的免疫荧光显著增加，持续至第2天。图1b-c显示了MCAM和PECAM1在第3至第7天随着四环素暴露时间的延长，免疫荧光强度逐渐增加，峰值在第7天。为了进一步分析这些细胞，作者进行了单细胞RNA测序(scRNAseq)，如图1d所示，识别出三个不同的细胞群(P1, P2, P3)。图1e显示了这些细胞群的UMAP图，反映了从早期、中期到晚期内皮祖细胞的发育轨迹。图1f-g进一步展示了每个细胞群的特征基因表达，P1为早期内皮样祖细胞，P2为中期内皮样祖细胞，P3为晚期内皮样祖细胞。

图2：展示了iETV2-hiPSCs在肾类器官中形成集成内皮网络并保持关键肾实质细胞类型的存在。

图2图2a显示了优化后的肾类器官生成流程，其中包含iETV2-hiPSCs。为了验证内皮网络的形成，作者使用免疫荧光染色法，如图2b所示，显示了血管化肾类器官中PECAM1标记的内皮细胞网络。通过使用Angiotool分析，图2c显示，与对照相比，血管化肾类器官的血管面积、总血管长度和连接点数量均显著增加。此外，图2d展示了NPHS1+足细胞被内皮细胞包裹的情况，且近端和远端小管也被内皮细胞包围。

图3：展示了单核RNA测序(snRNAseq)分析结果。

图3a为第18天MANZ2-2对照组和血管化肾类器官的单核RNA测序分析流程图。UMAP图如图3b所示，展示了对照组和血管化肾类器官中的不同细胞类型。图3c细胞类型特征图显示了典型的细胞类型特异性标记基因表达，进一步确认了不同细胞类型。图3d显示了对照组和血管化肾类器官中各细胞类型的百分比分布，表明血管化肾类器官中内皮细胞的比例显著增加。图3e进一步显示，EGFP表达主要集中在血管化肾类器官的内皮细胞中

图4：展示了血管化肾类器官中足细胞的更大分化和内皮细胞相互作用的改善

图4a-b显示了血管化肾类器官中NPHS1+足细胞与PECAM1+内皮细胞的相互作用，以及扫描电镜图像显示的内皮细胞包裹足细胞簇的情况。为了更清楚地了解这些相互作用，作者使用UMAP图(图4c-d)展示了控制组和血管化肾类器官中的足细胞分布情况。图4e图表展示了两种群体中足细胞的百分比分布，显示血管化肾类器官中的足细胞表达更高水平的成熟标志基因。图4f-g进一步展示了与基底膜形成和肾小球发育相关的基因表达显著增加。

图5：展示了血管化肾类器官中的相关情况。

图5 图5a-b的UMAP图显示了间质细胞的重新聚类及其亚群。图5c展示了每个亚群的特征基因表达，确认了血管平滑肌肾素阳性细胞和其他间质细胞类型。通过单细胞RNA测序，图5d-e显示了血管化肾类器官中肾素阳性细胞的出现。图5f-h的免疫荧光图像显示了肾素阳性细胞的位置及其与内皮细胞和足细胞的相邻关系。为了进一步验证功能性，图5i显示了福斯可林刺激下肾素表达显著增加。

图6：详细展示了iETV2-hiPSCs在肾类器官中的成功分化及其器官特异性成熟。

使用UMAP降维技术对MANZ2-2对照组和血管化肾类器官中的内皮细胞进行重新聚类(图6a)，结果显示这些细胞分布在低维空间中按其基因表达相似性聚类。进一步的分析表明，内皮细胞聚类成三种不同的亚型，分别为肾小球样、动脉样和静脉样内皮细胞(图6b)。通过使用已发表的内皮细胞亚型标记基因，确认了这些细胞的“身份”，并展示了PECAM1和CDH5标记的高表达水平，表明它们具有典型的内皮细胞特征。SingleCellNet分类结果进一步显示，这些内皮细胞与Tabula Sapiens数据库中的器官特异性内皮细胞数据集进行对比时，表现出强烈的肾脏特异性，表明它们在肾类器官培养过程中获得了肾脏特异性的成熟特征。扫描电镜图像显示，血管化肾类器官中的内皮细胞表面具有均匀分布的小孔结构，这对于肾小球的滤过功能至关重要。最后，免疫荧光染色显示，这些内皮细胞高表达小孔内皮细胞标志PLVAP，进一步支持了它们的成熟状态。这些结果表明，iETV2-hiPSCs在肾类器官中形成了功能性的血管网络，显著提高了肾类器官的血管化水平和器官特异性细胞类型的成熟。

研究结论

总之，研究人员成功生成了血管化的人类肾类器官，实现了多系成熟和功能性细胞的出现，为肾脏疾病的研究和治疗提供了新的工具和方法。