金属离子干扰荧光素酶检测？研究揭示三种酶的敏感性差异及应对策略

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Interference of metal ions on the bioluminescent signal of firefly, Renilla, and NanoLuc luciferases in high-throughput screening assays

中文标题：金属离子对高通量筛选中萤火虫、海肾及纳米荧光素酶生物发光信号的干扰

发表期刊：《Frontiers in Chemistry》

影响因子：4.2

作者单位：

Institute of Bioorganic Chemistry, Polish Academy of Sciences, Poznań, Poland

作者信息：

Francesca Canyelles i Font, Krzysztof Żukowski, Masroor A. Khan, Dorota Kwiatek, Jacek L. Kolanowski

研究背景

基于萤火虫荧光素酶(FLuc)、海肾荧光素酶(RLuc)和纳米荧光素酶(NLuc)的生物发光高通量筛选(HTS)广泛应用于药物发现，但金属离子(普遍存在于缓冲液、生物样本及化合物库中)可能干扰信号，导致假阳性 / 假阴性结果。本研究量化 21 种生物及环境相关金属离子对三种荧光素酶信号的影响，分析缓冲液、EDTA、谷胱甘肽(GSH)等因素的调节作用，为 HTS 实验设计、验证及数据解读提供依据。

研究方法

采用萤火虫(FLuc)、海肾(RLuc)和纳米(NLuc)三种荧光素酶建立高通量筛选模型，设置筛选条件(SC，含 EDTA、BSA 等添加剂)和 HEPES 优化体系(H，统一缓冲液减少差异);测试 21 种生物及环境相关金属离子在 0.01 mM、1 mM、5 mM 浓度下对生物发光信号的影响，通过 IC₅₀测定量化抑制强度;结合预孵育实验(改变金属离子与酶、底物、辅因子的孵育顺序)、EDTA 和谷胱甘肽(GSH)调节实验及 pH 测定，探究干扰机制及缓解方法，数据经 KNIME 软件分析并通过四参数逻辑回归计算 IC₅₀。

实验结果

图1：荧光素酶活性测定的质量控制

展示 FLuc、RLuc、NLuc 在 SC 和 H 缓冲体系中的 Z' 因子(均 > 0.5，符合 HTS 要求)和信号背景比(S/B)，其中 NLuc 在 H 体系中 Z' 因子最高(0.88)，FLuc 在 SC 中 S/B 最高(136)。结果验证了实验体系的稳定性和可靠性，为后续筛选奠定基础。

图2：金属离子浓度对生物发光信号的影响

在 0.01 mM、1 mM、5 mM 浓度下，多数金属离子对 FLuc 信号有显著淬灭作用(如 Ag、Cu²⁺、Fe³⁺在 0.01 mM 即几乎完全抑制)，对 NLuc 和 RLuc 的影响较弱(仅高浓度时显著)。其中，Cu、Zn、Fe 等符合 Irving–Williams 序列(Cu>Zn>Fe>Mn>Ca>Mg)，与 FLuc 抑制强度一致。结果表明荧光素酶对金属离子的敏感性存在差异，FLuc 最敏感。

图3：预孵育顺序对金属离子干扰的影响

FLuc 中，金属离子(如 Ag、Fe³⁺)与酶预孵育时淬灭作用更强，与底物或 ATP 预孵育时较弱，提示直接与酶结合是主要干扰机制;NLuc 和 RLuc 中，Ag、Zn 与酶预孵育淬灭更强，而 Cu²⁺与底物预孵育时干扰更显著，表明存在酶 - 金属和底物 - 金属两种作用途径。

图4：EDTA 对金属离子干扰的缓解作用

0.5 mM EDTA 可显著减弱 Cu²⁺、Zn²⁺对 NLuc 和 RLuc 的淬灭作用，对 Fe²⁺、Fe³⁺也有一定缓解，且不影响阴性对照信号。结果证实 EDTA 通过螯合金属离子降低干扰，是有效的缓冲液添加剂。

图5：GSH 对金属离子干扰的调节作用

2 mM GSH 可增强 RLuc 基础信号，减弱 Ag、Cu²⁺对三种荧光素酶的干扰，但对 FLuc 有非特异性淬灭;对 Fe 离子的影响较弱。结果表明 GSH 通过金属螯合和酶保护双重作用调节信号，需根据荧光素酶类型选择浓度。

研究结论

三种荧光素酶对金属离子的敏感性差异显著，FLuc 最敏感(IC₅₀多为亚微摩尔至微摩尔级)，NLuc 最稳定(IC₅₀多为毫摩尔级)，RLuc 介于两者之间;Cu⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺等是主要干扰者，符合 Irving–Williams 序列;缓冲体系影响显著，HEPES 缓冲液中干扰更强，筛选条件因含螯合剂可减弱干扰;EDTA 能有效缓解 Cu、Zn 等的干扰，GSH 可减弱 Ag、Cu 的干扰但对 FLuc 有非特异性影响，这些发现为高通量筛选实验设计和数据解读提供了关键参考。