牙髓干细胞类器官的构建与分析方案

发布时间：2025-08-17 17:19:53 细胞资源库平台访问量：7

近年来，类器官技术在生物医学研究领域取得了革命性进展，为体外培养工具创造了强大的三维模型，能够启动和扩展类器官样结构。类器官可以培养以复制不同器官，与其体内对应物相似，并被广泛用于研究感染性疾病、遗传疾病和肿瘤的模型。牙髓干细胞(DPSCs)是位于牙髓内的一种成体干细胞，具有自我更新和向多种细胞类型分化的潜能，包括成牙本质细胞、神经元和结缔组织细胞。这些细胞因其治疗潜力而被广泛研究，特别是在再生医学和组织重建领域。

除了在牙本质再生中的作用外，DPSCs还有助于骨重塑，并具有分化为多种组织的潜力，包括软骨、骨、脂肪、肝脏和神经组织。DPSCs产生牙组织的能力以及与其他间充质基质/干细胞群体的相似性，使它们在开发包括类器官在内的体外模型方面特别有前景。这些三维模型可用于模拟牙组织的发育，监测体外矿化、牙齿形成和再生等过程。

此外，这些类器官可以作为药物测试、评估治疗反应和了解牙科疾病机制的强大工具。当前研究旨在建立一个标准化的DPSCs类器官生产方案，为牙髓生物学研究提供新工具，为牙髓再生研究领域的未来应用铺平道路。相关研究结果以题Protocol for the generation and analysis of organoids from Dental pulp stem cells (DPSCs)发布在Tissue and cell期刊。

研究结果

1，类器官培养条件优化：研究通过细胞滴定实验确定了最佳起始细胞数量和Matrigel基质浓度。实验评估了25,000-100,000个细胞/类器官的不同细胞密度，发现75,000个细胞是细胞聚集的最佳条件。同时，未稀释的Matrigel基质对于最大化细胞聚集、类器官形成和后续发育至关重要。采用静态技术在96孔U型底板上培养细胞悬液，通过Incucyte系统监测类器官生长和细胞聚集过程。培养3天后观察到足够的细胞聚集，定义为t0时间点，培养26天后类器官直径达到约1.5毫米。

2，Matrigel基质去除方案建立：由于Matrigel基质含有RNA和蛋白质，会干扰后续的分子分析，研究开发了高效的基质去除方法。使用Cell Recovery Solution在4°C下孵育20分钟，重复两次处理，成功去除Matrigel基质。该方案显著改善了核酸和蛋白质提取效率，通过纳米光度计定量证实RNA提取成功，蛋白质浓度测定显示每8个类器官可提取约200微克蛋白质。去除基质后的免疫荧光成像质量显著提高，减少了DAPI自发荧光，改善了信噪比。

图1 类器官中去除Matrigel®基质步骤示意图

3，类器官分化诱导与表征：培养10天后，将类器官分为两组：对照组(CTR)在DMEM-LG培养基中维持，分化组在含有地塞米松(0.1μM)、L-抗坏血酸磷酸酯(50μM)和β-甘油磷酸(10mM)的成牙分化培养基中培养26天。免疫荧光分析显示，分化类器官中Runx2(成骨分化关键转录因子)表达增加，提示其正在变得更具成骨性。对照类器官中CD105表达较高，表明维持了干细胞特性。茜素红染色检测钙化沉积，分化类器官显示更高的碳酸钙沉积。

4，组织学与细胞活力分析：通过优化的免疫荧光染色方案研究类器官中特定蛋白质的表达。组织切片厚度优化为14μm，以防止样品降解。CCK-8分析和台盼蓝染色评估细胞活力，结果显示对照类器官含有更多细胞(580万)，而分化类器官细胞数量较少(400万±80万)，这可能归因于分化培养基减缓细胞生长并促进谱系特异性分化。苏木精-伊红染色和Ki67免疫荧光显示类器官内部(核心)区域仍有细胞活力，尽管在缺乏血管结构的情况下可能存在缺氧诱导的坏死核心。

图2 类器官免疫荧光实验步骤示意图

5，分子分析方法优化：建立了完整的RNA和蛋白质提取方案。RNA提取采用TRIzol试剂结合Zimo-Research试剂盒，包括样品制备、柱纯化、可选DNase处理、洗涤步骤和RNA洗脱等步骤。蛋白质提取包括机械破碎、化学裂解、超声处理(5个周期，每次1分钟超声后在冰上冷却5分钟)、离心分离和Bradford分析定量等步骤。这些优化方案确保了从类器官中高效提取高质量的核酸和蛋白质，为后续的分子生物学分析奠定了基础。

6，分析方法验证与应用前景：研究建立的标准化方案减少了实验间的变异性，促进了实验室间的数据共享，提高了独立研究结果的可比性。该方案的局限性包括Matrigel基质处理的变异性和其来源于小鼠肉瘤限制了临床应用。尽管如此，考虑到初步验证结果，该方案显示出良好的前景，可以改善类器官模型在再生研究中的应用，为牙髓疾病研究和新药测试提供可靠的体外模型平台。

图3 牙髓类器官生成过程的示意图