一氧化氮对LHON视网膜类器官代谢与存活的负面影响

Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种与线粒体DNA(mtDNA)突变明确相关的双侧视神经病变，主要影响年轻男性，患病率约为1:50,000。患者常出现视力下降和中心暗点，严重影响生活质量。尽管已知病理性mtDNA突变会导致视网膜神经节细胞(RGC)凋亡，但RGC死亡的确切机制尚不明确，可能涉及遗传、表观遗传或环境因素。LHON急性期视盘旁微血管扩张是诊断关键，且这些毛细血管在荧光血管造影中无渗漏，表明血-视网膜屏障功能完整。

2025年6月9日，发表在American Journal of Pathology上题为Nitric Oxide May Adversely Affect the Metabolism and Viability of Retinal Organoids Derived from Patients with Leber Hereditary Optic Neuropathy的研究鉴于氧化氮(NO)在不同浓度下的双重作用，研究者假设NO过度产生可能导致LHON患者视神经头周围毛细血管扩张并对RGC产生有害影响。然而，目前缺乏基于视网膜组织的直接证据。本研究通过评估NO对LHON患者来源的视网膜类器官(ROs)的影响，旨在填补这一空白，为理解LHON的病理机制提供新的视角。

研究结果

1，视网膜类器官(ROs)的生成。通过SFEBq法，iPS细胞在特定培养条件下逐步分化为具有视网膜特征的类器官。分化过程中，细胞首先形成胚体，随后逐渐发展为具有清晰外层神经上皮层的类器官，这些类器官在形态和分化标记物表达上均显示出视网膜特性。免疫组化染色进一步证实了类器官中视网膜标记物的存在，包括Rx、CRX、NeuN和Math5等，表明分化成功生成了视网膜类器官。此图为后续研究提供了基础，证明了使用iPS细胞生成视网膜类器官的可行性，为研究Leber遗传性视神经病变(LHON)的视网膜病理提供了有效的体外模型。

图1展示了使用无血清漂浮培养胚体样聚集体快速聚集法(SFEBq)从诱导多能干细胞(iPS)生成视网膜类器官(ROs)的过程。

2，急性亚硝酸钠(SNP)暴露对视网膜类器官(ROs)的影响。在不同浓度的SNP暴露下，类器官的形态发生了显著变化，随着SNP浓度的增加，类器官的外层视网膜层清晰度逐渐下降，结构在较高浓度下发生崩溃。TUNEL染色结果显示，SNP暴露导致类器官中凋亡细胞比例显著增加，特别是在患者来源的类器官中更为明显。这些结果表明，急性SNP暴露对视网膜类器官具有毒性作用，且患者来源的类器官对SNP更为敏感，提示NO在LHON发病机制中可能扮演重要角色。

图2展示了急性SNP暴露对视网膜类器官形态和凋亡的影响。

3，间歇性亚硝酸钠(SNP)暴露对视网膜类器官(ROs)的影响。结果显示，间歇性SNP暴露导致类器官中凋亡细胞比例显著增加，且这种增加在患者来源的类器官中更为显著。同时，mtDNA拷贝数在暴露后也有所增加，但两组之间的增加幅度无显著差异。这些结果表明，间歇性SNP暴露能够诱导视网膜类器官的凋亡，但对mtDNA拷贝数的影响在患者和控制来源的类器官之间无显著差异，提示NO对视网膜细胞的毒性作用可能不完全依赖于mtDNA拷贝数的变化。

图3展示了间歇性SNP暴露(三次24小时暴露，每次间隔24小时)对视网膜类器官凋亡和mtDNA拷贝数的影响。

4，连续亚硝酸钠(SNP)暴露对视网膜类器官(ROs)的影响。结果显示，连续SNP暴露导致患者来源的类器官中凋亡细胞比例显著增加，而在控制来源的类器官中增加不显著。同时，mtDNA拷贝数在控制来源的类器官中显著增加，但在患者来源的类器官中无显著变化。这些结果表明，连续SNP暴露对患者来源的视网膜类器官具有更强的毒性作用，且这种作用可能与mtDNA拷贝数的调节能力受损有关，提示LHON患者视网膜细胞在应对NO应激时可能存在缺陷。

图4展示了连续SNP暴露(72小时不间断暴露)对视网膜类器官凋亡和mtDNA拷贝数的影响。

5，连续SNP暴露后视网膜类器官(ROs)的代谢组学变化。通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，发现SNP暴露后患者和控制来源的类器官在代谢物谱上存在显著差异。特别是，SNP暴露导致患者来源的类器官中多种关键代谢物水平显著下降，包括牛磺酸、γ-氨基丁酸(GABA)等，这些代谢物对视网膜功能至关重要。代谢物富集分析进一步揭示了SNP暴露后患者来源类器官中代谢通路的显著改变，提示NO应激可能通过干扰视网膜代谢途径导致LHON的发生。

图5展示了连续SNP暴露后视网膜类器官的代谢组学变化。

6，定量代谢物富集分析。分析显示，SNP暴露后患者和控制来源的类器官在多个代谢通路上存在显著差异，特别是与能量代谢、氨基酸代谢和胆汁酸合成等相关的通路。这些结果表明，SNP暴露导致的代谢改变不仅限于特定代谢物，而是涉及多个代谢通路的广泛改变，进一步支持了NO在LHON发病机制中的重要作用。通过代谢物富集分析，我们能够更全面地理解SNP暴露对视网膜类器官代谢的影响，为LHON的病理机制提供了新的视角。

图6展示了基于小分子代谢通路数据库(SMPDB)的定量代谢物集富集分析结果。

全文总结

本研究使用患者来源的视网膜组织证实了LHON与NO之间的潜在联系，为理解LHON病理生理学提供了新的视角。研究发现LHON来源的视网膜类器官对NO诱导的损伤更加敏感，表现出代谢谱改变，特别是与神经元稳态相关的代谢物变化。这些发现不仅支持了NO过度产生可能导致视神经头周围毛细血管扩张并对LHON患者RGC产生有害影响的假设，还揭示了NO可能通过破坏代谢适应机制在LHON发病机制中发挥关键作用。研究结果为开发针对NO影响的治疗策略提供了理论基础，可能成为LHON治疗的突破口。此外，该研究方法学为使用患者特异性类器官模型研究罕见遗传性眼病提供了宝贵的技术平台。