从患者 iPSC 衍生视网膜类器官中无设备分离感光细胞

遗传性视网膜变性疾病会导致患者光感受器细胞逐渐丢失，最终引起进行性视力损失。虽然基因治疗在阻止疾病进展方面显示出前景，但视力恢复很可能需要光感受器细胞替代治疗。诱导多能干细胞(iPSC)来源的视网膜类器官是移植用光感受器细胞的理想来源，这些类器官能够忠实地重现人类视网膜的结构，包含命运确定的光感受器细胞。然而，视网膜类器官含有多种视网膜细胞类型，包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞等内层视网膜神经元，这些细胞对治疗效果无益，甚至可能降低最终治疗产品的效力。因此，迫切需要开发从解离的视网膜类器官中分离命运确定光感受器细胞的方法。

2025年6月12日，发表在Jci Insight上题为Device-free isolation of photoreceptor cells from patient iPSC-derived retinal organoids的研究提出了一种部分解离技术，利用视网膜类器官的高度组织化结构，在不使用专门设备或抗体标记等试剂的情况下，选择性富集光感受器细胞。通过在不同时间点收集解离过程中释放的细胞，研究团队成功实现了高达90%的光感受器细胞纯度。该方法依赖于标准塑料器皿和符合cGMP标准的商业试剂，具有成本低、操作简便、临床可转化性强等优点，为自体光感受器细胞替代治疗的临床应用提供了新的技术路径。

研究结果

1，视网膜类器官结构特征与部分解离策略。

研究发现，使用现代3D分化方案产生的视网膜类器官表现出特征性的层状结构，光感受器细胞位于最外层，这种结构与正常人类视网膜的架构高度相似。基于这一观察，研究团队提出了部分解离的假设：在酶解过程中，外层的光感受器细胞会首先被释放，从而允许分离纯化的光感受器细胞。实验采用木瓜蛋白酶进行分阶段部分解离，在不同时间点收集释放的细胞，最后将剩余的实体类器官通过机械吹打完全解离。

2，光感受器细胞富集效果验证。

通过免疫细胞化学(ICC)分析发现，部分解离能够释放富含NRL阳性视杆细胞和ARR3阳性视锥光感受器的细胞群体。与对照组的完全解离相比，部分解离获得的细胞群体在光感受器细胞纯度方面显著提高，最高可达90%。重要的是，分离出的视锥细胞上存在ARR3阳性的外节样突起，表明部分解离是一种温和的过程，对光感受器细胞造成的破坏最小。同时，完全解离剩余组织获得的细胞悬液中光感受器细胞明显减少，证实了部分解离细胞中观察到的光感受器富集效果并非由于两组类器官之间组成差异造成的。

3，分子水平表征与解离动力学分析。

qPCR和流式细胞术分析进一步证实了部分解离的有效性。随着解离时间的延长，与光感受器和光感受器前体相关的基因表达逐渐降低，而RPE标记物的表达相应增加。流式细胞术定量分析显示，部分解离过程中光感受器细胞纯度随解离时间呈下降趋势。这些结果共同证实了在部分解离过程中，视网膜类器官的外层首先被释放，从而能够产生富集光感受器细胞的细胞群体。解离动力学分析还揭示了一个重要特征：在组织良好的类器官中，解离速率在初期下降后会再次增加，这可能与到达外丛状层时解离停滞有关。

4，不同患者之间的差异性分析。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析显示，不同患者iPSC系产生的类器官质量存在显著差异。组织良好的第4系类器官具有清晰的层状结构，其外层包含大量光感受器细胞;而第3系类器官虽然也能有效产生视网膜类器官，但通常组织较差，缺乏清晰的层状结构，且常含有大量视网膜色素上皮(RPE)聚集体。尽管存在结构差异，两个细胞系都含有相同的细胞类型集合，具有相似的基因表达模式。重要的是，组织良好的类器官在富集部分(即光感受器细胞纯度高于对照解离的部分)中产生了更多细胞，表明该富集策略能够以合理的总产量分离光感受器细胞。

5，类器官组织程度对富集效果的影响。

为了确认类器官结构对富集效果的影响，研究团队对第5系进行了分析，该系能够产生组织良好和组织较差两种类型的视网膜类器官。组织良好的类器官具有清晰的外核层(ONL)，而组织较差的类器官缺乏明显的ONL且含有大量RPE聚集体。结果显示，组织良好的类器官产生的解离部分具有更高的光感受器细胞富集度，并表现出与第4系相同的特征性解离动力学特征。这些发现表明，通过手动预筛选具有明显层状结构的类器官，可以提高该技术的性能和适用性，尽管这种策略的废料水平并不理想。

全文总结

本研究开发的部分解离技术为临床级光感受器细胞制备提供创新方案，仅需标准塑料器皿和商业化 cGMP 合规试剂，降低监管负担与成本，避免移植细胞暴露于动物来源抗体的风险，提高安全性。该技术可选择性富集光感受器细胞，提升治疗产品效力，确保移植细胞主要由对视力恢复有贡献的细胞组成。此外，解离动力学特征为监控解离过程提供时间无关指标，减少批次间变异性，为细胞制备提供质量控制手段，为自体光感受器细胞替代治疗发展奠定重要基础。