STEAP3通过调控铁代谢缓解缺血再灌注相关的肺损伤

呼吸道合胞病毒(RSV)是导致婴幼儿和老年人严重呼吸道感染的重要病原体，但 RSV 疫苗开发面临关键挑战 —— 其融合蛋白(F 蛋白)的天然构象不稳定，难以维持引发高效免疫应答的前融合状态(pre-F)。近日，《Journal of Virology》发表的研究通过引入四个疏水氨基酸突变，成功开发出高稳定性的 pre-F-IFLP 蛋白，其表达水平、热稳定性及抗酸碱能力均显著优于第一代 pre-F 疫苗 DS-Cav1，且在小鼠模型中诱导的中和抗体效价提升 72 倍，为开发更高效的 RSV 疫苗提供了新策略。

研究背景

RSV 每年导致全球数十万儿童和老年人死亡，但其疫苗开发进展缓慢。RSV F 蛋白是疫苗研发的核心靶点，其中前融合构象(pre-F)比后融合构象(post-F)能引发更强的中和抗体反应。然而，pre-F 天然状态下极易转变为稳定的 post-F，且蛋白表达量低，成为疫苗开发的主要障碍。第一代 pre-F 疫苗 DS-Cav1 通过二硫键和空腔填充突变稳定 pre-F，但存在表达量低和储存稳定性差的问题。因此，亟需开发兼具高稳定性和高表达量的 pre-F 变体，以提升疫苗效力。

研究结果

图1：RSV F 蛋白突变体的细胞表面稳定性分析

研究设计了多种 F 蛋白突变体，通过免疫荧光和流式细胞术发现，引入 N67I、S190F、V207L、S215P 四个疏水突变的 pre-F-IFLP，在 37℃和 55℃条件下均维持更高比例的 pre-F 构象(D25 抗体染色阳性)，且蛋白表达量显著高于 DS-Cav1。相比之下，DS 突变虽提升稳定性但降低表达，而 SC-DM/TM 等单链突变体稳定性无显著改善。细胞融合实验显示，pre-F-IFLP 的膜融合活性降低，表明其构象更稳定。

图2：pre-F-IFLP 的热稳定性、酸碱抗性及储存寿命分析

可溶性 pre-F-IFLP 在 55℃加热或 pH 3.5/10 处理后，仍保持 80% 以上的 pre-F 构象，而 DS-Cav1 和野生型 F 蛋白几乎完全转变为 post-F。储存实验表明，pre-F-IFLP 在 25℃保存 30 天后仍有 60% 以上维持 pre-F 构象，显著优于 DS-Cav1(30 天仅 20%)。这些结果证实疏水突变通过增强蛋白内部疏水相互作用，显著提升了 pre-F 的理化稳定性。

图3：pre-F-IFLP 与中和抗体的结合亲和力分析

表面等离子共振(SPR)显示，pre-F-IFLP 与 pre-F 特异性抗体 D25 的结合亲和力(KD<0.024 nM)比 DS-Cav1(KD=0.282 nM)高 11.7 倍，与 AM14 和 motavizumab 等中和抗体的结合亲和力相当。天然 PAGE 和 Western blot 证实 pre-F-IFLP 维持三聚体结构，且抗原表位未因突变而改变，表明其保留了引发中和抗体的关键抗原位点。

图4：pre-F-IFLP 诱导的中和抗体及对 RSV 感染的保护作用

小鼠免疫实验显示，pre-F-IFLP 两次免疫后诱导的中和抗体效价(ID50=64,000)是 DS-Cav1(ID50=890)的 72 倍，且结合抗体效价与中和效价的比值更低，表明抗体功能更高效。攻毒实验中，pre-F-IFLP 免疫组小鼠肺组织病毒载量较 DS-Cav1 组降低 6.3 倍，病理损伤(如支气管炎、肺泡炎)显著减轻，血清促炎因子 IL-6 和 IFN-γ 水平降低，证实其能完全保护小鼠免受 RSV 感染。

图5：pre-F-IFLP 免疫后小鼠血清的中和效力分析

二次免疫后，pre-F-IFLP 组小鼠血清的中和滴度(ID50)达到 64,000，较一次免疫后提升 32 倍，是 DS-Cav1 组(ID50=890)的 72 倍，且其抗体结合效价与中和效价比值更低，功能更高效。pre-F-IFLP 免疫血清能显著减少 RSV F 蛋白与 HEp-2 细胞的结合(流式细胞术检测 MFI 降低 40%)，并在 RSV F 介导的细胞融合实验中几乎完全抑制多核合胞体形成，而 DS-Cav1 血清仅能部分抑制，表明 pre-F-IFLP 诱导的抗体中和活性更强。

图6：pre-F-IFLP 对 RSV 感染的体内保护效果

内容：攻毒后 5 天，pre-F-IFLP 组小鼠肺组织病毒滴度较 DS-Cav1 组降低 6.3 倍(2,068 倍 vs 328 倍)，接近未感染水平，且肺部病理评分较佐剂对照组降低 70%，仅见轻微炎症细胞浸润。pre-F-IFLP 组小鼠血清促炎因子 IL-6 水平较 DS-Cav1 组降低 50%，肺组织中 RSV F 抗原阳性细胞数量减少 90%，病毒 NS1 和 F 基因转录水平几乎不可测，证实其能完全抑制 RSV 感染并减轻过度免疫反应。

研究结论

本研究通过引入四个疏水氨基酸突变(N67I、S190F、V207L、S215P)，成功开发出高稳定性的 pre-F-IFLP 蛋白，为 RSV 疫苗研发提供了突破性进展。实验证实，pre-F-IFLP 通过增强蛋白内部疏水相互作用，在细胞表面表达量提升 2.6 倍的同时，显著改善了热稳定性(55℃处理后 pre-F 构象保留率超 80%)、抗酸碱能力(pH 3.5/10 处理后构象稳定)及储存寿命(25℃保存 30 天仍保留 60% pre-F 构象)。其与 pre-F 特异性抗体 D25 的结合亲和力提升 11.7 倍，且在小鼠模型中诱导的中和抗体效价较 DS-Cav1 提高 72 倍，能完全抑制 RSV 感染导致的肺部病理损伤及病毒复制。该研究提出的 “疏水突变稳定 pre-F” 策略，为解决 RSV 疫苗开发中的蛋白稳定性与免疫原性矛盾提供了新路径，有望推动高效 RSV 疫苗的临床转化。