miRNA-29b-1-5p：靶向 HBV 入侵受体，为抗乙肝治疗提供新方向

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：miRNA-29b-1-5p mediates an antiviral activity by targeting the HBV entry receptor in human hepatocytes

中文标题：miRNA-29b-1-5p 通过靶向 HBV 入侵受体在人肝细胞中发挥抗病毒作用

发表期刊：《Scientific Reports》

影响因子：3.9

作者单位：

1. Liver Cancer Prevention Research Unit, RIKEN Cluster for Pioneering Research, Wako, Japan

2. Research Center for Drug and Vaccine Development, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan

3. Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan

作者信息：

Luc Gailhouste, Yutaka Furutani, Xian-Yang Qin

研究背景

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大健康负担，影响超过 2.5 亿人，可导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。现有干扰素和核苷类似物疗法无法清除共价闭合环状 DNA(cccDNA)，需终身治疗，且存在病毒反弹风险。HBV 入侵依赖肝细胞表面受体 NTCP(钠 - 牛磺胆酸共转运多肽)，靶向 NTCP 的抑制剂已显示出潜力。微小 RNA(miRNA)通过靶向 mRNA 的 3'UTR 调控基因表达，在病毒感染中起重要作用。本研究探究 IFN 诱导的 miRNA 是否通过靶向 NTCP 抑制 HBV 感染，为开发 RNA 疗法提供依据。

研究方法

使用原代人肝细胞(PHHs)、HepG2 肝细胞株及 HBV 稳定复制株 HepG2.2.15，PHHs 培养于胶原包被板及专用培养基，其他细胞使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基;PHHs 经 IFN 类似物 CDM-3008 处理后，通过 miRNA 芯片筛选差异表达 miRNA，qPCR 验证 miR-29b-1-5p 的上调，利用 TargetScanHuman 预测其与 NTCP 3'UTR 的结合位点;向 PHHs 转染 miR-29b-1-5p 模拟物或对照，qPCR 检测 NTCP mRNA 水平，构建含 NTCP 3'UTR(野生型及突变型)的双荧光素酶报告载体，与 miRNA 共转染 HepG2 细胞验证直接靶向作用;PHHs 转染 miRNA 后 4 天感染 HBV(100 基因组拷贝 / 细胞)，qPCR 检测 intracellular HBV DNA 及前基因组 RNA(pgRNA)水平，XTT 法评估细胞活力;共转染 miR-29b-1-5p 与 NTCP 过表达载体，检测 HBV DNA 及 pgRNA 水平验证 NTCP 的介导作用。

实验结果

图1：IFN 类似物 CDM-3008 诱导 miR-29b-1-5p 表达并潜在靶向 NTCP

显示 CDM-3008 处理后 PHHs 中 4 种 miRNA 显著上调(如 miR-29b-1-5p)、1 种下调;通过 TargetScanHuman 预测显示 miR-29b-1-5p 与 NTCP 3'UTR 存在结合位点;qPCR 验证 CDM-3008 处理后 miR-29b-1-5p 随时间上调，NTCP 则下调，两者呈显著负相关。结果提示 miR-29b-1-5p 可能受 IFN 诱导并调控 NTCP。

图2：miR-29b-1-5p 直接靶向 NTCP 3'UTR

显示 PHHs 转染 miR-29b-1-5p 模拟物后，其表达显著升高;qPCR 显示 NTCP mRNA 水平显著降低;双荧光素酶报告实验表明，miR-29b-1-5p 可抑制野生型 NTCP 3'UTR 的荧光活性，对突变型无影响。结果证实 miR-29b-1-5p 通过靶向 NTCP 3'UTR 抑制其表达。

图3：miR-29b-1-5p 降低 HBV 基因组水平

实验设计为转染 miRNA 后 4 天感染 HBV;显示 miR-29b-1-5p 组 HBV DNA 拷贝数在感染后 14 天显著低于对照组，HBV pgRNA 水平也显著降低，且无细胞毒性。结果表明 miR-29b-1-5p 具有抗 HBV 活性。

图4：NTCP 过表达逆转 miR-29b-1-5p 的抗病毒作用

rescue 实验设计为共转染 NTCP 过表达载体;显示共转染后，miR-29b-1-5p 组的 HBV DNA 及 pgRNA 水平与对照组无显著差异;机制示意图显示 miR-29b-1-5p 靶向 NTCP 3'UTR 抑制 HBV 入侵。结果证实 miR-29b-1-5p 的抗病毒作用依赖于 NTCP 抑制。

研究结论

miR-29b-1-5p 是 IFN 类似物诱导的抗病毒 miRNA，通过直接靶向 NTCP 的 3'UTR 抑制其表达，从而减少 HBV 入侵及基因组复制，且该作用可被 NTCP 过表达逆转。本研究揭示了 miRNA 调控 HBV 入侵的新机制，支持 miR-29b-1-5p 作为靶向 NTCP 的 RNA 疗法候选分子，为慢性 HBV 感染的治疗提供了新策略。