凝溶胶蛋白通过F-肌动蛋白调控和P53降解在MASH中的保护作用

基本信息

英文标题：Gelsolin’s Protective Role in MASH through F-Actin

Regulation and P53 Degradation

中文标题：凝溶胶蛋白通过F-肌动蛋白调控和P53降解在MASH中的保护作用

发表期刊：《Advanced Science》

影响因子：14.3

作者单位：浙江大学医学院附属邵逸夫医院普外科，国家微创器械创新与应用工程技术研究中心，浙江省腹腔镜技术重点实验室

作者信息：

Yiwei Lu, Tong Ji, Zhichao Ye, Jianing Yan, Chao Wang, Jiachen Chen, Ziyang Jin,

Yongji Zhu, Xiujun Cai,* and Yifan Wang

研究背景

MASH的现状与挑战

MASH(代谢相关脂肪性肝炎)是代谢功能障碍相关脂肪肝病(MAFLD)的进展阶段，以肝脂肪变性、炎症和纤维化为特征，可发展为肝硬化甚至肝癌。

目前MASH的治疗选择有限，亟需探索新的分子机制和治疗靶点。

Gelsolin(GSN)的功能

GSN是一种肌动蛋白结合蛋白，调控细胞骨架动态和炎症反应，但其在MASH中的作用尚未明确。

研究创新点

首次揭示GSN在MASH中通过调控F-肌动蛋白和P53降解发挥保护作用。

发现GSN通过抑制YAP活性和促进P53泛素化降解，减轻肝脂肪变性和纤维化

研究方法

动物模型

构建全球性GSN敲除(Gsn−/−)小鼠，并采用三种饮食模型(MCD、CDAHFD、HFD)诱导MASH。

通过AAV8载体恢复GSN表达，验证其治疗潜力。

细胞实验

使用PA(棕榈酸)处理AML12肝细胞，模拟MASH代谢压力。

通过siRNA和过表达技术调控GSN、ATF3、MDM2和P53的表达。

分子机制

免疫共沉淀(Co-IP)验证GSN与MDM2的相互作用。

染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验证实ATF3对GSN的转录调控。

实验结果

图1：GSN表达水平与MASH样本疾病严重程度呈正相关

研究整合了来自GEO数据库(GSE48452、GSE61620、GSE33814和GSE63067)的183例患者数据，计算不同病程阶段患者的Gsn表达水平;同时采集106例不同NAFLD活动度评分患者的肝脏样本进行转录组分析。Gsn mRNA表达量以均值±标准差(SD)形式呈现。

(A、B)采用Pearson相关性分析评估Gsn mRNA水平与NAFLD活动评分的关联性。

(C)Western blot定量数据对应D组实验结果;

(D)通过Western blot检测人类肝脏组织中GSN蛋白表达水平。组织样本(每组n=4-6);(E-G)通过蛋白质印迹分析评估了喂食蛋氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD，E)、胆碱缺乏L-氨基酸定义高脂饮食(CDAHFD，F)和高脂饮食(HFD，G)的小鼠肝组织中GSN表达水平在不同时间点的变化，以标准饮食(STD)组小鼠作为每种饮食干预的对照组(每组n=3-6);(H-J)图(E)-(G)蛋白质印迹结果的定量数据;通过定量PCR分析评估了喂食K)MCD、L)CDAHFD和M)HFD的小鼠肝组织中Gsn表达水平在不同时间点的变化，以STD组小鼠作为每种饮食干预的对照组(每组n=3-6);

(N)采用代表性免疫组化染色评估喂食MCD、CDAHFD和HFD饮食的小鼠肝组织切片中GSN表达，以STD组小鼠作为每种饮食干预的对照组(每组n=3-6)，比例尺为100微米;O)通过代表性免疫荧光染色评估喂食MCD饮食、CDAHFD和HFD的小鼠肝切片中GSN表达，以STD组小鼠作为每种饮食干预的对照组(每组n=3-6)，比例尺为100微米;P-R)图(N)免疫组化中GSN阳性区域的定量分析。

(S-U)图(O)免疫荧光染色中GSN阳性肝细胞的定量分析;数据以均值±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析确定显著性差异。双尾p<0.05被认为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.无显著性)。

图2：GSN缓解体内小鼠模型中MASH的疾病进展

A,B) 各组小鼠血清ALT和AST水平(n=6/组);

C)各组小鼠肝组织甘油三酯水平(n=6/组);

D)各组小鼠肝组织羟脯氨酸水平(n=6/组);

E)MCD饲料组小鼠肝组织苏木精-伊红(H&E)染色(50×，标尺：250μm)、H&E放大(200×，标尺：50μm)、油红O染色(100×，标尺：250μm)、天狼星红染色(100×，标尺：250μm)代表性图像(n=6/组);F) MCD饲料组𝛼-SMA(100×，标尺：100μm)、COL1A1(100×，标尺：100μm)、F4/80(100×，标尺：100μm)免疫组化染色代表性图像(n=6/组);

F)CDAHFD饲料组H&E染色(50×，标尺：250μm)、H&E放大(200×，标尺：50μm)、油红O染色(100×，标尺：250μm)、天狼星红染色(100×，标尺：250μm)代表性图像(n=6/组);H) CDAHFD饲料组𝛼-SMA(100×，标尺：100μm)、COL1A1(100×，标尺：100μm)、F4/80(100×，标尺：100μm)免疫组化染色代表性图像(n=6/组);

(I,J) Western blot分析MCD饲料组小鼠肝组织GSN、FASN、ACC1、ACLY、IL-1𝛽、TNF-𝛼、IL-6、𝛼-SMA和COL1A1在不同时间点的表达水平(n=3/组);K,L) Western blot分析CDAHFD饲料组小鼠肝组织GSN、FASN、ACC1、ACLY、IL-1𝛽、TNF-𝛼、IL-6、𝛼-SMA和COL1A1在不同时间点的表达水平(n=3/组);实时荧光定量PCR分析各组小鼠肝组织M)脂代谢分子、N)炎症反应标志物和O)纤维化相关标志物的表达(n=6/组);P) MCD饲料组小鼠血清炎症因子(TNF-𝛼、IL-1𝛽、IL-6)ELISA检测结果(n=6/组);Q) CDAHFD饲料组小鼠血清炎症因子(TNF-𝛼、IL-1𝛽、IL-6)ELISA检测结果(n=6/组)。数据以均值±标准差(SD)表示，采用Student's t检验或单因素方差分析进行显著性检验，双尾p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图3：GSN恢复可减轻MCD喂养Gsn−/−小鼠的肝损伤

A)各实验组(n=3-6/组)的代表性图像：苏木精-伊红(H&E)染色(50×，比例尺：250μm)、H&E放大图(200×，比例尺：50μm)、油红O染色(50×，比例尺：250μm)、天狼星红染色(50×，比例尺：250μm);

B)各实验组(n=3-6/组)的代表性免疫组化(IHC)染色图像：α-SMA(100×，比例尺：100μm)、COL1A1(100×，比例尺：100μm)、F4/80(100×，比例尺：100μm);

C-F) 采用Western blot分析评估MCD喂养小鼠肝组织中GSN、FASN、ACC1、ACLY、IL-1β、TNF-α、IL-6、α-SMA和COL1A1在不同时间点的表达水平(n=3/组);

G,H) 指定组小鼠血清ALT和AST水平(n=3-6/组);

I)指定组小鼠肝组织中的甘油三酯水平(n=3-6/组);

J) 指定组小鼠肝组织中的羟脯氨酸水平(n=3-6/组);数据以均值±标准差(SD)表示。采用Student t检验或单因素方差分析判定显著性差异。双尾p<0.05被认为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图4：

A) GSN抑制AML12细胞的炎症反应和脂质蓄积。

B) 通过蛋白质印迹分析评估AML12细胞在不同时间点经0.3×10−3摩尔棕榈酸(PA)处理后的GSN表达水平，以及经不同浓度PA处理24小时后的表达情况;

C,D) 采用免疫荧光分析评估AML12细胞在不同时间点经0.3×10−3摩尔棕榈酸(PA)处理后的GSN表达水平，以及经不同浓度PA处理24小时后的表达情况;

E,F) Gsn基因敲除细胞、过表达细胞及经BSA或PA处理24小时的对应对照组细胞的油红O染色代表性图像;

G,H) 甘油三酯水平在Gsn敲低细胞、过表达细胞及经BSA或PA处理24小时的相应对照细胞。数据来自三次独立实验。比例尺为20和25微米;

I,J) PA处理下Gsn敲除和过表达细胞中脂质代谢相关基因的蛋白表达水平。K,L) PA处理下Gsn敲除和过表达细胞中脂质代谢相关基因的相对mRNA水平(n=3次独立实验，mRNA表达水平以β-肌动蛋白为内参标准化)。M,N) BSA或PA处理下Gsn敲除和过表达细胞上清液中炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的ELISA检测结果(n=3次独立实验);数据以均值±标准差(SD)表示。采用Student t检验或单因素方差分析判定显著性差异，双尾p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图5：Gsn缺失导致的F-肌动蛋白解聚异常引发YAP过度激活，加剧MASH中的肝纤维化和炎症

C)Western blot结果显示MCD或CDAHFD饮食喂养的WT/Gsn−/−小鼠肝组织中活化YAP的表达情况，以标准饮食(STD)组小鼠作为各饮食干预的对照组(n=3/组);

C,D) 图(A)和(B)Western blot结果的定量数据;MCD或CDAHFD饮食喂养小鼠肝组织的代表性免疫荧光图像，STD饮食组作为对照组(n=6/组，红色：活化YAP，绿色：HNF4𝛼，蓝色：DAPI);图(E)免疫荧光染色的定量分析;

G)采用MCD或CDAHFD饲料喂养的小鼠肝脏组织中活化YAP的代表性免疫组化染色图像，以STD饲料组小鼠作为对照组(n=6/组)。(H)对(G)组免疫组化染色结果的定量分析。(I)不同实验组AML12细胞中经BSA或PA处理的GSN与F-肌动蛋白代表性免疫荧光染色图像(n=3/组);(J)对(I)组GSN免疫荧光染色的定量分析;(K)对(I)组F-肌动蛋白免疫荧光染色的定量分析;(L)不同实验组AML12细胞经BSA或PA处理后GSN、活化YAP、IL-1β、TNF-α及IL-6表达水平(n=3/组);(M)对(L)组Western blot结果的定量数据。数据以均值±标准差(SD)表示，采用单因素方差分析判定显著性差异，双尾检验p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图6：细胞松弛素B逆转了由Gsn缺失引起的YAP激活增强

A)不同实验组(每组n=3)经BSA或PA处理的AML12细胞中GSN、活化态YAP、TNF-𝛼、IL-1𝛽、IL-6的蛋白表达水平;

B)图(A)中Western blot结果的定量数据

D-F) 测量不同处理组细胞及小鼠肝组织各组中F-actin与G-actin的比例;

G)经BSA或PA处理的不同组AML12细胞中a-YAP和F-actin的代表性免疫荧光染色图像实验组(每组n=3);H)对(G)组免疫荧光染色进行定量分析;

I)AML12细胞中活化YAP与F-肌动蛋白的相关性分析。数据以均值±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析判定显著性差异。双尾检验p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.无显著性差异)。

图7：GSN与MDM2共表达并促进P53泛素

A-C) Western blot检测结果：喂食MCD或CDAHFD饲料的WT/Gsn−/−小鼠肝组织中P53和MDM2的表达情况，以标准饲料(STD)喂养的小鼠作为各饮食干预的对照组(n=3/组);

D)代表性免疫组化(IHC)染色图像：展示MCD或CDAHFD饲料喂养小鼠肝组织中P53的表达情况，以STD喂养小鼠作为对照组(n=6/组)。

E-I) Western blot分析显示GSN和P53蛋白水平，以GAPDH作为上样对照。F,G) 实验条件：棕榈酸(PA)、对照sgRNA(sg-Ctrl)、Gsn sgRNA(sg-Gsn)和MG132处理下的细胞。H,I) 实验条件：棕榈酸(PA)、PLVX载体、Gsn过表达(PF-Gsn)及MG132处理组。J-M)环己酰亚胺(CHX)追踪实验显示P53和GSN蛋白随时间变化的稳定性，以GAPDH作为上样对照。J,L)分别展示转导对照sgRNA(sg-Ctrl)和Gsn sgRNA(sg-Gsn)的细胞在不同时间点(0、20、40、80、120分钟)的蛋白水平。K,M)展示转导PLVX载体和Gsn过表达(PF-Gsn)的细胞在不同时间点(0、10、20、30、40、60分钟)的蛋白水平。

O)蛋白质印迹分析不同处理对P53、MDM2和GSN蛋白水平的影响，以GAPDH作为上样对照。实验组分别采用棕榈酸(PA)、PLVX载体、Gsn过表达(PF-Gsn)、对照siRNA(si-Ctrl)和Mdm2 siRNA(si-Mdm2)处理。

P,Q)免疫共沉淀分析显示STD和MCD处理条件下GSN与MDM2的相互作用。P)使用抗GSN抗体进行免疫沉淀检测结合的MDM2水平。Q)使用抗MDM2抗体进行免疫沉淀检测结合的GSN水平。实验包含Input和IgG对照。

N,O)体内免疫共沉淀实验证实MDM2与GSN的共表达，实验包含Input和IgG对照。

S)在293T细胞中进行的体外免疫共沉淀实验观察到MDM2与GSN共表达。Input样本显示蛋白表达水平，以GAPDH作为上样对照。数据以均值±标准差(SD)表示，采用单因素方差分析进行显著性检验。双尾检验p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图8：GSN通过增强MDM2介导的P53泛素化减轻肝脏脂肪变性

A)采用免疫共沉淀(IP)和泛素化实验检测野生型/Gsn基因敲除小鼠在MCD或CDAHFD饮食喂养下肝组织中P53的修饰情况，标准饮食(STD)组小鼠作为各饮食干预的对照组(n=3/组);

B,C)在过表达或敲低Gsn的293T细胞中进行P53免疫共沉淀及泛素化检测，实验中使用MG132抑制蛋白酶体降解途径，采用HA标签标记的P53进行IP后，通过免疫印迹(IB)检测MYC标签泛素(MYC-UB)或泛素;

E)在敲低MDM2的293T细胞中检测P53免疫共沉淀及泛素化水平，使用MG132处理细胞抑制蛋白酶体降解，采用P53抗体进行IP后通过IB检测泛素;

E,F)P53免疫共沉淀后通过IB检测其相互作用蛋白MDM2和GSN;G–I)分析FLAG-GSN表达量增加对MYC-MDM2与HA-P53相互作用的影响，采用P53抗体进行IP后通过IB检测FLAG、MYC和HA标签。数据以均值±标准差(SD)表示，采用单因素方差分析进行显著性检验，双尾检验p<0.05视为具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001，n.s.表示无显著性差异)。

图9：转录因子ATF3在MASH进展过程中上调GSN表达

A)AML12细胞经BSA或PA处理24小时后Atf3 mRNA表达的Q-PCR分析;

B)采用蛋白质印迹法评估人肝组织样本中ATF3蛋白表达(n=4-6/组);

C)图(B)蛋白质印迹结果的定量数据;

D-I) 通过蛋白质印迹分析评估蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD，D,G)、胆碱缺乏L-氨基酸限定高脂饮食(CDAHFD，H)和高脂饮食(HFD，I)喂养小鼠不同时间点肝组织中ATF3及其他分子的表达水平及定量数据，以标准饮食(STD)小鼠作为各饮食干预的对照组(n=3/组);

J)蛋白质印迹分析显示ATF3和GSN蛋白水平，GAPDH作为上样对照。细胞处理条件：对照shRNA(sh-Ctrl)、Atf3-shRNA#1(sh-Atf3#1)、Atf3-shRNA#2(sh-Atf3#2)、Atf3-shRNA#3(sh-Atf3#3);K) 图(J)蛋白质印迹结果的定量数据;L,M) Q-PCR分析显示Atf3(L)和Gsn(M)转录水平。细胞处理条件：对照shRNA(sh-Ctrl)、Atf3-shRNA#1(sh-Atf3#1)、Atf3-shRNA#2(sh-Atf3#2)、Atf3-shRNA#3(sh-Atf3#3);N) 蛋白质印迹分析显示ATF3和GSN蛋白水平，以GAPDH作为上样对照。细胞处理条件：BSA或PA，对照shRNA(sh-Ctrl)，Atf3-shRNA(sh-Atf3);

P)图(N)中Western印迹结果的定量数据;

Q)在BSA或PA处理24小时的AML12细胞中，ATF3蛋白在Gsn启动子区域富集的染色质免疫沉淀分析，IgG作为阴性对照;

Q)在PA处理24小时的shNC或shAtf3感染AML12细胞中，Gsn启动子活性的双荧光素酶报告基因检测，荧光素酶活性通过内部海肾荧光素酶对照进行标准化(n = 3)。数据以均值±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析确定显著性差异，双尾检验p < 0.05视为具有统计学意义(*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005，****p < 0.001，n.s.表示无显著性)。

图10：本研究探讨的分子机制示意图。GSN通过促进P53蛋白的泛素化降解来抑制脂质沉积

在GSN正常表达情况下，肝脏中GSN与MDM2相互作用，增强MDM2介导的P53泛素化降解，导致P53表达水平降低并阻碍其有效核转位。这一机制在MASH病程中调控肝脏脂质代谢，减轻脂质蓄积和肝脏脂肪变性。而在GSN缺失(Gsn−/−)状态下，MDM2介导的P53降解受阻，导致脂质沉积增加，加剧肝脏脂肪变性和代谢功能障碍。

除调控P53外，GSN作为关键细胞骨架蛋白，通过动态调节F-肌动蛋白与G-肌动蛋白的比例，确保过量F-肌动蛋白被降解为G-肌动蛋白。这一机制可防止F-肌动蛋白过度积累，维持细胞稳定性。该调控过程间接抑制Hippo通路关键效应因子YAP的过度激活。在Gsn−/−肝细胞中，F-肌动蛋白与G-肌动蛋白的失衡导致过量F-肌动蛋白无法及时解聚为G-肌动蛋白单体。F-肌动蛋白的病理性积累使得YAP在Hippo通路调控前即被过度激活，进而促进MASH病程中肝纤维化加剧和炎症信号通路激活，进一步恶化肝损伤。

GSN通过调控F-肌动蛋白、YAP活性以及促进MDM2介导的P53降解，在维持肝脏代谢稳态、调节脂质代谢和控制炎症反应中发挥核心作用。这些发现揭示了GSN在肝脏功能中的多维调控机制，为MASH治疗提供了潜在靶点。

研究结论

GSN表达与MASH严重程度相关：GSN在MASH患者和小鼠模型中表达上调，且与疾病进展呈正相关。GSN缺失加剧MASH病理，Gsn−/−小鼠表现出更严重的肝脂肪变性、炎症和纤维化。细胞实验中，GSN缺失导致F-肌动蛋白积累和YAP过度激活。GSN恢复改善肝损伤，AAV介导的GSN恢复显著减轻肝损伤和纤维化。GSN通过促进MDM2介导的P53泛素化降解，减少肝脂肪变性。GSN抑制F-肌动蛋白积累，从而抑制YAP的核转位和激活。ATF3是GSN的上游转录调控因子。

创新策略：

揭示GSN通过双重机制(F-肌动蛋白/YAP和MDM2/P53通路)保护MASH。

转化意义：

GSN是MASH的潜在治疗靶点，其调控机制为开发新型疗法提供理论基础。