基于生物发光的活细胞内源性蛋白质相互作用定量检测方法

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Chemotactic Zn micromotor for treatment of high blood ammonia-associated hepatic encephalopathy

中文标题：趋化性锌微马达用于治疗高血氨相关肝性脑病

发表期刊：《Nature Communications》

影响因子：14.7

作者单位：中山大学材料科学与工程学院、丽水市人民医院慢性肝病与肝癌联合诊疗重点实验室、荷兰拉德堡德大学分子与材料研究所、南方医科大学药学院广东省新药筛选重点实验室

作者信息：

Ye Feng, Chao Gao, Xiuyun Peng, Bin Chen, Miaomiao Ding, Dailing Du, Jinghui Rong, Qi Lv, Daniela A. Wilson, Yingfeng Tu, Fei Peng

研究背景

蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPIs)是细胞信号网络的核心，其异常与癌症、神经退行性疾病等多种疾病密切相关，靶向异常 PPIs 是潜在的治疗策略。然而，传统药物发现平台常依赖质粒驱动的过表达模型，难以复现内源性环境中 PPIs 的复杂性和动态变化。本研究旨在评估纳米荧光素酶二元技术(NanoBiT)和纳米荧光素酶生物发光共振能量转移(NanoBRET)在活细胞中定量内源性蛋白质相互作用的应用价值，通过 CRISPR 介导的基因组编辑在 DLD-1 和 HCT 116 细胞系中整合 NanoBiT 和 NanoBRET 标签，针对 EGFR/GRB2 和 KRas/CRAF 等疾病相关 PPIs，在单层培养、动力学测量、发光成像及 3D 球体模型中验证方法的有效性，为解析信号机制和筛选靶向 PPIs 的治疗药物提供更具生理相关性的工具。

研究方法

本研究通过 CRISPR 介导的基因组编辑技术，在 DLD-1 和 HCT 116 细胞系的 EGFR/GRB2 和 KRas/CRAF 基因座分别整合 NanoBiT(LgBiT/SmBiT)和 NanoBRET(Nluc/HaloTag)融合标签，利用 DNA 修复抑制剂(AZD7648 和 PolQi3)提高同源定向修复效率，经单细胞分选获得纯合克隆，通过数字 dropletPCR(ddPCR)和 Sanger 测序验证编辑准确性。在实验模型中，对编辑后的细胞系进行 EGF 刺激或 RAF 抑制剂处理，采用终点法和动力学测量评估 PPIs，结合生物发光成像观察相互作用的时空分布;进一步在癌症相关同基因细胞系(如 EGFR T790M 突变体)和 3D 球体模型中扩展应用，通过 NanoBiT 的发光信号和 NanoBRET 的供体 / 受体信号比定量分析 PPIs 的动态变化及药物调控效应。

实验结果

图1：EGF 诱导的 EGFR/GRB2 相互作用的响应幅度和动力学

A、B 图显示 NanoBiT 和 NanoBRET 检测 EGF 诱导的 EGFR/GRB2 相互作用的剂量响应曲线，EC50 分别为 11 ng/ml 和 14 ng/ml，Hill 斜率接近;C、D 图为动力学曲线，NanoBiT 达峰时间约 90 s，NanoBRET 约 60 s，两者均能捕捉后续的信号衰减。结果表明两种技术均可灵敏检测 EGFR/GRB2 相互作用，动力学差异与报告系统的生物物理特性相关(NanoBRET 无需重组，响应更快)。

图2：EGFR/GRB2 NanoBRET 响应的生物发光成像

A 图(EGFR-Nluc 供体信号)和 B 图(GRB2-HT 受体信号)显示 EGF 处理后不同时间点的相互作用分布：0 s 时存在基础相互作用，66 s 时 GRB2 向细胞膜 EGFR 募集，957 s 时复合物内化呈点状分布。成像结果验证了 EGFR/GRB2 相互作用的时空动态，与内吞和信号脱敏的生理过程一致，证明方法可捕捉 PPIs 的亚细胞定位变化。

图3：EGFR WT 和 T790M 突变体对 RTKi 的敏感性差异

A、B 图分别为 EGFR WT 和 T790M 细胞中不同 RTKi(吉非替尼、奥希替尼等)的抑制曲线：WT 细胞对吉非替尼(IC50 9.59 nM)和厄洛替尼(25.3 nM)敏感，T790M 突变体则对奥希替尼(409.4 nM)和 WZ8040(42.7 nM)更敏感，吉非替尼抑制效果显著降低(IC50 从 9.59 nM 升至 112.0 μM)。结果表明该模型可准确反映突变对药物敏感性的影响，适用于耐药机制研究和新药筛选。

图4：RAF 抑制剂诱导的 KRas/CRAF 二聚化检测

A、B 图显示不同 RAF 抑制剂处理后 KRas/CRAF 相互作用的剂量响应，LY3009120 和 GDC0879 可显著诱导相互作用，PLX8394 则无明显效果;C、D 图动力学曲线显示 LY3009120 诱导的复合物更稳定;E、F 图显示 GDC0879 处理后复合物快速解离，而 LY3009120 处理后解离缓慢。结果可区分不同类型 RAF 抑制剂的作用机制(I 型 vs II 型)，验证了方法对 PPIs 动态调控的检测能力。

图5：同基因细胞系中 KRas/CRAF 动态的差异

A 图显示 KRas G13D 纯合子细胞的基础信号最高，WT/- 细胞最低;B 图 EGF 刺激后，WT/- 细胞响应最显著，G13D 纯合子响应最弱。结果表明 KRas 突变状态影响其与 CRAF 的基础相互作用及 EGF 诱导的响应，与突变体 constit 激活的特性一致，证明模型可用于解析基因突变对 PPIs 的影响。

图6：3D 球体模型中 KRas/CRAF 相互作用的检测

A 图显示 RAF 抑制剂在 3D 球体中诱导 KRas/CRAF 相互作用的剂量响应;B 图成像显示 LY3009120 处理后球体中 BRET 信号增强，且供体 / 受体信号共定位。结果验证了方法在 3D 模型中的适用性，可捕捉更接近体内微环境的 PPIs 特征，为药物穿透和肿瘤微环境研究提供工具。

研究结论

CRISPR 介导的内源性标签整合可有效构建 NanoBiT 和 NanoBRET 报告细胞系，实现对 EGFR/GRB2 和 KRas/CRAF 等 PPIs 的定量检测：两种技术在 EGF 刺激下检测 EGFR/GRB2 相互作用的 EC50 值接近(11 ng/ml vs 14 ng/ml)，NanoBRET 动力学响应更快(达峰约 60 s)，NanoBiT 则更适合长期监测;在 KRas/CRAF 模型中，可区分不同 RAF 抑制剂诱导的相互作用差异(如 LY3009120 诱导的复合物更稳定)，且能检测 EGFR T790M 等突变对药物敏感性的影响。此外，该方法可扩展至 3D 球体模型，捕捉更接近体内环境的 PPIs 特征。综上，内源性报告细胞系克服了过表达模型的 artifacts，为解析生理状态下的 PPIs 机制、评估药物效能及开发靶向疗法提供了高特异性和可重复性的平台。