检测新突破3步搞定尼帕病毒抗体筛查！这种 "混合-读取" 技术让高危病毒监测更简单

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Streamlined detection of Nipah virus antibodies using a split NanoLuc biosensor

中文标题：基于分裂型 NanoLuc 生物传感器的尼帕病毒抗体简化检测方法

发表期刊：《Emerging Microbes Infect》

影响因子：8.4

作者单位：

1. Viral Special Pathogens Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA

2. Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia, Athens, USA

3. icddr,b, Dhaka, Bangladesh

作者信息：

Éric Bergeron、Cheng-Feng Chiang、Michael K. Lo

研究背景

尼帕病毒(NiV)是一种高致死性人畜共患病 RNA 病毒，可引发人类和动物的严重呼吸道及神经系统疾病。现有检测方法(如 ELISA、中和试验)存在操作复杂、需高等级实验室等局限，难以在流行地区(如孟加拉国)推广。本研究旨在开发一种基于分裂型 NanoLuc 荧光素酶(split NanoLuc)的生物传感器，通过 “混合 - 读取” 模式快速检测 NiV 抗体，以优化 NiV 的诊断和监测。

研究方法

研究人员收集了孟加拉国 NiV 疫情期间疑似感染患者的样本、美国居民的血清样本以及马来西亚疫情的残留样本 。其中，孟加拉国样本经 γ 射线灭活，美国样本经 56°C 加热 30min 灭活。利用多种方法制备病毒库存、细胞裂解物、细胞匀浆和抗体，并获取 WHO 提供的 NiV 抗体国际标准样本。通过间接 IgG ELISA、IgM 捕获 ELISA、制备并纯化 NiV G 生物传感器进行 αNiV-G 混合读取(MR)测定、病毒中和试验，结合数据分析，评估生物传感器检测 NiV 抗体的性能。

实验结果

图1. αNiV-G 生物传感器设计与检测原理

将 NiV G 蛋白与 NanoLuc 的 SmBiT 和 LgBiT 片段融合构建生物传感器，C 端融合效果更佳。当样本中存在抗 NiV G 抗体时，其会同时结合 G-SmBiT 和 G-LgBiT，使 NanoLuc 重组，加入底物后产生荧光信号，根据荧光强度可判断抗体的存在及含量，为后续检测奠定了理论基础。

图2. 生物传感器浓度优化与单克隆抗体验证

经实验优化，C 端融合生物传感器在 7.5nM 浓度时信号 - 噪声比最佳。不同单克隆抗体实验显示，抗 G 单克隆抗体如 7B7、nAH1.3 能特异性激活传感器，而抗 F 抗体无此作用，这表明该生物传感器对检测抗 NiV G 抗体具有高度特异性。

图3. 孟加拉国临床样本的 IgM/IgG 分布

分析 712 份样本发现，IgM+IgG-(急性期)占 31.2% ，IgM+IgG+(过渡期)占 19.3%，IgM-IgG+(恢复期)占 49.5%。这一分布情况为评估生物传感器在不同感染阶段样本中的检测效果提供了样本基础，也显示出该生物传感器对 IgG + 样本检测效果显著。

图4. αNiV-G 生物传感器的 ROC 曲线分析

对 IgG + 样本的曲线下面积(AUC)达 0.999 ，敏感性 98.6%、特异性 100%，检测性能优异。然而对单纯 IgM + 样本，AUC 仅为 0.7038，检测效果较差，说明该生物传感器在检测早期感染样本时存在局限性。

图5. 动物样本中的 NiV 抗体检测

检测美国非 NiV 流行地区猪、猫、狗血清，以及马来西亚自然感染猪、孟加拉国蝙蝠和猫狗血清。结果显示，马来西亚猪、孟加拉国犬和蝙蝠血清的 SNR 显著高于美国阴性对照，证明生物传感器可跨物种检测 NiV 抗体，在动物宿主监测方面具有应用潜力。

图6. αNiV-G 生物传感器对其他副粘病毒的交叉反应评估

研究测试了 αNiV-G 生物传感器对其他副粘病毒抗体的交叉反应性。使用针对 Sosuga 病毒(SosV)、副流感病毒 1(PIV1)、副流感病毒 5(PIV5)、尼帕病毒(NiV)和亨德拉病毒(HeV)的小鼠高免疫腹水进行实验。结果显示，仅抗 NiV 和抗 HeV 抗体显著激活生物传感器，SNR 值分别为 1086 和 500，而其他病毒抗体的 SNR 值均低于阈值(虚线)，表明该传感器与 HeV 存在交叉反应，但对其他副粘病毒特异性良好 6-82🔷。这提示在 HeV 流行地区使用时需结合中和试验区分抗体来源。

图7. 尼帕病毒幸存者抗体反应的时间动态检测

对 10 名孟加拉国 NiV 幸存者的纵向样本进行分析，发现症状出现后 8 天内的样本(如患者 1、2)αNiV-G MR 检测均为阴性，但 IgM 阳性;症状出现 11 天后的样本全部转为阳性。SNR 值随时间持续升高，且 8 年后仍维持较高水平(如患者 3、8)，同时中和抗体滴度(VNT)在 80 至 5120 之间波动。这表明 αNiV-G MR 检测在症状出现后 1-2 周才呈阳性，但抗体一旦产生可长期存在，支持该技术用于回顾性疫情调查 6-86🔷。

图8. 动物宿主中抗尼帕病毒抗体的检测

利用 αNiV-G MR 检测猪、犬、猫和蝙蝠等动物血清中的 NiV 抗体。马来西亚 NiV 疫情中自然感染的猪、孟加拉国的犬和蝙蝠血清样本显示强阳性 SNR 信号，而美国非流行地区的动物血清均为阴性。其中，蝙蝠血清(Pteropus spp. IgG+)和马来西亚猪血清的 SNR 值分别为 32 和 1024，显著高于美国对照(如犬、猫样本 SNR<1)。结果证实该生物传感器可跨物种检测 NiV 抗体，适用于动物宿主监测及生态流行病学研究 6-94🔷。

研究结论

本研究开发并验证了一种基于分裂型 NanoLuc 荧光素酶的 NiV 糖蛋白生物传感器，用于检测临床和动物样本中的抗体。该 “混合 - 读取” 检测方法简单快速，敏感性达 98.6%、特异性 100%，与抗 NiV IgG ELISA 性能相当，但无法有效检测症状出现 1 周内的早期样本。NiV 幸存者的抗体可长期存在，至少 8 年。该生物传感器还能检测动物样本中的抗体，有望用于 NiV 监测和疫情回顾性调查。