让耗竭T细胞‘发光’！新型小鼠模型助力破解癌症免疫治疗难题

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A novel TOX-nanoluciferase reporter mouse for exploring modulators of T cell exhaustion

中文标题：一种用于探索T细胞耗竭调节因子的新型TOX-纳米荧光素酶报告小鼠模型

发表期刊：《J. Immunol》

影响因子：3.8

作者单位：

1.Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands

2.Department of Radiology & Nuclear Medicine, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands

3.Department of Cell Biology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands

作者信息：Ling Li, Yvonne M. Mueller, Kou Hioki

研究背景

T细胞耗竭是慢性感染和癌症中因持续T细胞受体(TCR)刺激导致的功能失调状态，表现为抑制性受体(如PD-1、LAG-3)高表达、效应功能丧失及转录谱改变。转录因子TOX在此过程中起关键作用：其短暂表达于急性感染中的效应T细胞，但在慢性刺激下持续高表达，驱动耗竭表型并抑制抗肿瘤活性。研究表明，下调TOX可增强CD8+ T细胞的抗肿瘤功能并提高免疫检查点阻断(ICB)疗效，但缺乏实时监测TOX动态的工具限制了相关机制研究和药物开发。为此，本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了一种新型TOX-纳米荧光素酶(NLuc)报告小鼠模型，将NLuc基因敲入Tox位点，使TOX表达与生物发光信号同步，旨在实时追踪T细胞耗竭过程并筛选调控TOX的化合物，为逆转耗竭和优化免疫治疗提供技术平台。

研究方法

研究通过CRISPR/Cas9技术将T2A-NLuc序列精准插入C57BL/6J小鼠Tox基因终止密码子下游，构建Tox-NLuc报告小鼠，并通过与OT-I小鼠(表达OVA特异性TCR)杂交获得Tox-NLuc-OT-I品系。体外实验中，分离小鼠脾脏CD8+ T细胞，通过反复OVA肽刺激(5天)诱导耗竭表型，以单次刺激或未刺激细胞作为对照。TOX表达通过荧光素酶检测(Nano-Glo试剂)量化，并利用流式细胞术验证TOX蛋白水平及耗竭标志物(PD-1、LAG-3、TCF-1等)。为验证模型实用性，耗竭CTL分别用ibrutinib(ITK抑制剂，1μM)和bryostatin-1(PKC调节剂，10nM)处理3天，分析荧光信号和TOX表达变化。数据通过IVIS成像系统、流式细胞仪(LSRFortessa)及统计学软件(GraphPad Prism)处理，采用t检验或ANOVA分析差异。

实验结果

图1：CRISPR/Cas9介导的TOX-NLuc基因敲入策略

本图展示了通过CRISPR/Cas9技术将NanoLuc(NLuc)报告基因插入小鼠Tox位点的设计流程。图A显示sgRNA靶向Tox基因第9外显子终止密码子附近的PAM序列(AACTCCTCAGTGGAAAGAAG)，引导Cas9核酸酶产生双链断裂(DSB)。图B详细解析了同源重组修复模板的结构：5'和3'同源臂分别与基因组断裂点两侧匹配，中间插入T2A肽序列(54bp)和NLuc基因(516bp)，确保TOX与NLuc共表达但独立翻译。单链DNA(ssDNA)模板通过磷酸化PCR制备，以提高敲入效率。最终，通过显微注射将CRISPR组分导入小鼠受精卵，获得Tox-NLuc转基因小鼠，并通过PCR和测序验证插入位点及序列完整性。该策略实现了TOX表达的实时光学监测，为后续功能研究奠定基础。

图2：T细胞激活诱导TOX与荧光素酶表达上调

本研究通过抗CD3/CD28抗体刺激Tox-NLuc小鼠的CD8+ T细胞，验证模型对TOX动态的响应能力。

图A显示，刺激24小时后，荧光信号较未刺激组增强2倍，表明TCR激活驱动TOX转录并触发NLuc表达。

图B通过流式细胞术进一步证实，刺激后TOX蛋白平均荧光强度(MFI)显著升高(*P<0.05)，且与荧光信号变化一致。此外，胸腺细胞因TOX基础表达较高，其荧光信号呈细胞数量依赖性，与脾细胞相比差异显著(图S3A)。该结果确认了模型的灵敏性和特异性，为后续耗竭研究中TOX监测提供了方法学依据。

图3：体外诱导T细胞耗竭的表型特征

通过反复OVA肽刺激Tox-NLuc-OT-I小鼠的CD8+ T细胞(5天)，成功诱导耗竭表型。

图A显示，耗竭CTL高表达PD-1、LAG-3和TIM-3，而效应细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌减少(图B)。

图C表明，耗竭伴随转录因子TCF-1(干细胞样耗竭前体细胞标志)下调，符合耗竭T细胞的典型特征。流式数据进一步显示，耗竭组TOX蛋白MFI较单次刺激组升高1.8倍(图4D)，与荧光信号增强趋势一致。此模型重现了慢性抗原暴露导致的T细胞功能障碍，为研究耗竭机制及干预策略提供了标准化平台。

图4：耗竭CTL中TOX-NLuc信号增强及药物干预效果

反复OVA刺激的耗竭CTL表现出显著升高的荧光信号(较单次刺激组增强7倍)，且可通过IVIS成像系统直观检测(图C)。

图D流式验证耗竭组TOX MFI显著高于对照组(**P<0.01)，且荧光信号与TOX表达呈线性正相关(R²=0.82，图E)。

为测试药物筛选潜力，耗竭CTL分别用ibrutinib或bryostatin-1处理3天，结果显示两者均显著降低荧光信号(分别下降71%和65%)及TOX蛋白水平(图5B、D)。

此结果证明模型可快速、定量评估化合物对TOX的调控作用，具备高通量筛选潜力。

图5：Ibrutinib和Bryostatin-1逆转TOX表达

研究利用Tox-NLuc-OT-I模型评估两种药物对耗竭CTL的调控作用。

图A显示，ibrutinib(1μM)处理3天后，荧光信号较未处理组降低71%，流式检测TOX MFI同步下降(图B)。

类似地，bryostatin-1(10nM)处理使荧光信号和TOX MFI分别减少65%和60%(图C-D)。

机制上，ibrutinib通过抑制ITK削弱TCR-NFAT信号，而bryostatin-1可能通过PKC-MAPK通路下调TOX转录。两种药物均能打破TOX维持的耗竭程序，提示其作为ICB辅助疗法的潜力。

该实验验证了模型在药物发现中的应用价值，为后续体内外研究提供数据支持。

研究结论

研究成功构建了Tox-NLuc报告小鼠模型，证实TOX表达与生物发光信号高度相关：在激活或耗竭CD8+ T细胞中，荧光信号较未刺激细胞显著增强(反复刺激组信号为单次刺激的1.45倍)。模型进一步用于药物筛选，发现ibrutinib和bryostatin-1处理可分别降低耗竭CTL的荧光信号71%和65%，且流式验证TOX蛋白同步下调。结果表明，该模型能实时、灵敏地反映TOX动态，并兼容体外高通量筛选。此外，Tox-NLuc-OT-I小鼠结合可控的T细胞耗竭诱导系统，为解析耗竭机制、评估药物疗效及开发联合免疫疗法(如ICB+TOX抑制剂)提供了高效工具。未来可扩展至体内肿瘤模型，研究TOX在微环境中的调控网络。