SOX4通过EBF2介导的产热基因程序促进小鼠棕色脂肪的发育和维持

基本信息

英文标题：SOX4 facilitates brown fat development and maintenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice

中文标题：SOX4通过EBF2介导的产热基因程序促进小鼠棕色脂肪的发育和维持

发表期刊：《Cell death and differentiation》

影响因子：13.7

作者单位：

细胞应激生物学国家重点实验室，细胞信号网络创新中心，教育部分子诊断工程研究中心

厦门大学附属第一医院厦门心血管病研究所心脏电生理重点实验室

厦门大学医学院健康与医学数据科学国家研究所

中国科学院深圳先进技术研究院

作者信息：

Shuai Wang;Ting He;Ya Luo;Kexin Ren;Huanming Shen;Lingfeng Hou;Yixin Wei;Tong Fu;Wenlong Xie;Peng Wang;Jie Hu;Yu Zhu;Zhengrong Huang;Qiyuan Li;Weihua Li;Huiling Guo;Boan Li

研究背景

棕色脂肪的研究

大量研究表明，代谢活跃的棕色脂肪存在于婴儿和成人中，并且人类BAT活动的增加与体重下降相关。因此，促进BAT的发展和功能可能是对抗肥胖及相关代谢紊乱的一种有前途的策略。

棕色脂肪的调控因子

几种转录调控因子已被证明参与了BAT的发展和功能。先前的谱系研究表明，经典的棕色脂肪细胞来源于在胚胎发育过程中表达En1、Pax3、Pax7和Myf5的多能祖细胞。在BAT发育过程中，这些祖细胞发展为前脂肪细胞，随后通过转录级联分化为棕色脂肪细胞。早期B细胞因子2(EBF2)是棕色脂肪细胞命运的关键转录调控因子。它能够招募过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)，这是一种在脂肪细胞分化过程中关键的转录因子，到其棕色特异性结合位点，以维持BAT身份。去除对EBF2的抑制作用可以增强白色脂肪细胞的产热潜力。最近的研究表明，EBF2增强了ERRα/PGC1α复合物的转录活性，以促进产热基因的表达并维持BAT的核心温度。这些发现表明EBF2对于棕色脂肪细胞分化和产热功能至关重要。然而，EBF2的转录调控因子仍然未知。

SOX4的作用

SRY相关高迁移率组盒转录因子4(SOX4)是Sox C家族的一员，包含高迁移率组DNA结合域(HMG-Box域)和C端转录激活域(TAD域)。它在调节细胞干性、细胞分化以及神经系统、内分泌岛和心脏的发育中起关键作用。我们发现SOX4不仅抑制WAT中的前脂肪细胞决定，而且在长期寒冷暴露期间作为PPARγ的共激活因子促进米色脂肪细胞的形成。

SOX4与棕色脂肪

尽管棕色和米色脂肪分化的调控涉及一组重叠的泛脂肪生成和BAT特异性转录在现有研究中，SOX4在决定棕色脂肪细胞命运中的潜在作用尚不明确。我们发现，SOX4通过促进Ebf2的转录，对小鼠的褐色脂肪组织发育和产热功能至关重要，这一过程可能受到PKA激活的促进。

研究意义

我们的研究揭示了SOX4在调控产热基因程序中的调节作用和机制，并表明靶向SOX4可能是对抗肥胖以提高能量消耗的一种潜在策略。

研究方法

实验动物与饲养条件

小鼠种类为C57BL/6遗传背景的雄性，在22–24°C温度、50–60%湿度、12小时光照/黑暗周期下群居笼中饲养。

饮食条件

小鼠分别接受含67.4%碳水化合物、20.6%蛋白质、12%脂肪的普通饮食，或含20%碳水化合物、20%蛋白质、60%脂肪的高脂饮食。

免疫组化和免疫荧光

使用HE染色、免疫荧光和免疫组化技术对小鼠组织进行染色和观察，以研究特定蛋白的表达和定位。

透射电子显微镜

通过透射电子显微镜技术观察小鼠BAT组织的超微结构。

身体成分分析

使用Echo MRI组成分析仪评估小鼠的脂肪和瘦肉质量。

红外热成像和耐寒测试(CTT)

通过红外热成像和耐寒测试来评估小鼠的体温调节能力。

基因表达分析

使用定量PCR和RNA-Seq技术分析小鼠组织中基因的表达水平。

细胞培养与脂肪细胞分化

在体外培养小鼠BAT前脂肪细胞，并通过特定培养基诱导其分化为成熟的棕色脂肪细胞。

油红O染色和甘油三酯测量

通过油红O染色观察细胞内脂滴的形成，并测量甘油三酯水平以评估脂肪细胞的脂肪积累。

棕色脂肪细胞氧消耗率(OCR)测定

使用XF96 Extracellular Flux Analyzer测定分化后的棕色脂肪细胞的氧消耗率，以评估其代谢活性。

腺病毒的构建、纯化和注射

构建并纯化携带Sox4基因的腺病毒，并将其注射到小鼠BAT中以实现SOX4的过表达。

腺相关病毒(AAV)的包装和纯化

构建并纯化携带SOX4基因的腺相关病毒，通过尾静脉注射到小鼠体内以实现SOX4的过表达。

荧光素酶报告基因实验

构建荧光素酶报告基因质粒，通过转染细胞和测定荧光素酶活性来研究基因启动子的活性。

染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP测序分析

通过ChIP技术结合高通量测序分析SOX4蛋白在基因组中的结合位点。

实验结果

Sox4-MKO小鼠构建：通过Myf5-Cre小鼠与Sox4f/f小鼠交配，特异性地在BAT中敲除Sox4基因。

SOX4蛋白水平降低：Sox4-MKO小鼠的BAT、iWAT和gWAT中SOX4蛋白水平显著降低。

BAT形态学改变：Sox4-MKO小鼠的BAT组织形态发生改变，脂滴大小显著减小。

胚胎BAT发育异常：E15.5 Sox4-MKO胚胎的肩胛间BAT区域发育异常，SOX4和UCP1表达降低。

ob/ob小鼠BAT变化：ob/ob小鼠BAT中SOX4和UCP1蛋白及mRNA水平均降低。

饮食影响BAT：高脂饮食喂养的小鼠BAT中SOX4和UCP1表达降低。

年龄影响BAT：随着年龄增长，小鼠BAT中SOX4和UCP1表达降低。

Sox4-MKO新生鼠产热不足：Sox4-MKO新生鼠在冷暴露下皮肤温度降低，表明产热能力受损。

Sox4-MKO成鼠体温调节受损：Sox4-MKO成鼠在冷暴露后核心体温下降，血糖和血清游离脂肪酸水平升高，BAT中甘油三酯含量降低。

Sox4-MKO成鼠能量代谢降低：Sox4-MKO成鼠在冷暴露下氧消耗和热量产生降低，对β3-肾上腺素能受体激动剂的反应减弱。

Sox4-BKO新生鼠产热不足：Sox4-BKO新生鼠在冷暴露下皮肤温度降低，表明产热能力受损。

Sox4-BKO成鼠体温调节受损：Sox4-BKO成鼠在冷暴露后核心体温下降，血糖和血清游离脂肪酸水平升高，BAT中甘油三酯含量降低。

Sox4-BKO成鼠能量代谢降低：Sox4-BKO成鼠在冷暴露下氧消耗和热量产生降低。

Sox4-MKO小鼠对高脂饮食更易感：Sox4-MKO小鼠在高脂饮食喂养下体重增加更多，显示出对肥胖的易感性。

葡萄糖耐量受损：Sox4-MKO小鼠在葡萄糖耐量测试中血糖水平更高，表明葡萄糖代谢受损。

胰岛素耐量受损：Sox4-MKO小鼠在胰岛素耐量测试中血糖水平更高，表明胰岛素敏感性降低。

脂肪质量和分布改变：Sox4-MKO小鼠的脂肪质量和瘦肉质量比例改变，BAT、iWAT、gWAT和肝脏的重量与体重比例增加。

脂肪组织形态学改变：Sox4-MKO小鼠的脂肪组织显示脂滴增大，炎症标记物F4/80表达增加。

代谢活动降低：Sox4-MKO小鼠的食物摄入量、运动活动、氧消耗和产热均降低，表明整体代谢活动下降。

Sox4-MKO小鼠BAT超微结构改变：透射电子显微镜显示Sox4-MKO小鼠的BAT中线粒体数量减少，脂滴增大。

线粒体蛋白表达降低：免疫荧光和qPCR分析显示Sox4-MKO小鼠BAT中TOM20和线粒体DNA的转录本表达降低。

RNA测序揭示基因表达变化：RNA测序和热图分析显示Sox4-MKO小鼠BAT中大量基因表达下调，包括线粒体功能和脂肪代谢相关基因。

线粒体功能基因表达降低：RT-PCR分析显示Sox4-MKO小鼠BAT中线粒体复合物基因表达降低。

BAT特异性基因表达降低：RT-PCR分析显示Sox4-MKO小鼠BAT中多个BAT特异性基因表达降低。

蛋白水平降低：Western blot分析显示Sox4-MKO小鼠BAT中SOX4、线粒体呼吸链成分、BAT特异性蛋白和AGT蛋白的表达降低。

Sox4在棕色脂肪细胞分化中的必要性：通过慢病毒介导的shRNA技术，在体外抑制Sox4表达，发现Sox4对于棕色脂肪细胞的分化是必需的。

Sox4缺失影响脂肪积累：Sox4缺失导致分化后的棕色脂肪细胞中脂滴减少，甘油三酯含量降低。

BAT特异性基因表达降低：Sox4缺失导致棕色脂肪细胞中BAT特异性基因的mRNA水平显著降低。

WAT特异性基因表达增加：Sox4缺失导致棕色脂肪细胞中WAT特异性基因的mRNA水平增加。

蛋白水平降低：Sox4缺失导致棕色脂肪细胞中BAT富集蛋白和AGT蛋白的表达降低。

线粒体数量减少：Sox4缺失导致棕色脂肪细胞中线粒体DNA的转录本表达降低。

氧消耗率降低：Sox4缺失导致棕色脂肪细胞的氧消耗率降低，表明其代谢活性下降。

RNA测序与基因本体分析：RNA测序数据显示Sox4-MKO和Ebf2-AKO BAT中重叠下调基因，基因本体分析揭示与BAT发育相关基因显著下调。

ChIP测序结果：ChIP测序显示SOX4在Ebf2启动子上游-4k处显著富集结合，表明直接调控关系。

ChIP分析：ChIP分析证实SOX4蛋白在BAT SVF中Ebf2启动子上游-4k处有显著占用。

萤光素酶活性实验：NIH3T3细胞中，SOX4转染显著增强野生型pGL4.26-EBF2载体的萤光素酶活性，突变载体无此效应。

Ebf2启动子转录活性：NIH3T3细胞中，SOX4显著提高Ebf2启动子的相对转录活性，ΔHMG和ΔTAD突变体活性降低。

FAIRE实验：BAT SVF细胞感染shSOX4慢病毒后，Ebf2启动子区域的染色质开放性降低。

免疫荧光分析：E15.5 Sox4f/f和Sox4-MKO胚胎中，Sox4-MKO胚胎的EBF2表达显著降低。

UMAP图：E10.5到E13.5小鼠胚胎间充质和骨骼肌细胞的UMAP图显示BAT发育区域的细胞簇。

发育阶段细胞突出显示：UMAP图中根据发育阶段起源突出显示细胞。

Sox4和Ebf2表达模式：不同细胞簇中Sox4和Ebf2的表达模式显示其相关性。

平均表达水平：E10.5到E13.5小鼠胚胎中Ebf2和Sox4的平均表达水平显示其协同变化。

人类iPSCs分化表达：人类iPSCs分化为棕色脂肪细胞过程中，Sox4和Ebf2的mRNA表达水平同步变化。

免疫染色实验：BAT SVF细胞在不同培养基中处理1小时后，免疫染色显示SOX4的核定位变化。

ChIP-Seq分析：对照组和3X HA-SOX4表达的BAT SVF细胞在不同培养基中处理，ChIP-Seq分析显示SOX4在Ebf2启动子上的结合模式及新发基序。

免疫荧光实验：BAT SVF细胞经不同处理(DMSO、佛司可林、H89)后，佛司可林刺激显示SOX4蛋白核转位增强。

ChIP-qPCR：未处理或佛司可林处理的BAT SVF中，SOX4在Ebf2启动子上的占有率显著增加。

RT-qPCR分析：Sox4-MKO和对照小鼠的BAT SVF细胞经佛司可林处理后，Ebf2 mRNA水平显著变化。

冷暴露实验：Sox4f/f和Sox4-MKO小鼠在冷暴露后，BAT中Ebf2的表达水平显著不同。

萤火虫报告基因实验：不同处理的BAT SVF细胞中，Ebf2增强子的转录活性显著变化。

质谱分析：HEK293T细胞共转染WT-PRKACA或KD-PRKACA与HA-SOX4，质谱分析显示SOX4磷酸化位点。

氨基酸残基比对：不同物种SOX4残基S325及其相邻氨基酸残基的比对。

免疫荧光实验：NIH3T3细胞转染Flag-SOX4(WT或S235A突变体)，佛司可林处理后SOX4核转位变化。

qPCR分析：NIH3T3细胞转染Flag-SOX4(WT或S235A突变体)，佛司可林处理后Ebf2 mRNA水平变化。

机制图解：佛司可林诱导PKA激活，SOX4在S235处磷酸化，核转位后与EBF2合作激活EBF2转录。

免疫荧光分析：SOX4和EBF2在成熟BAT脂肪细胞核中共定位，提示功能相互作用。

免疫沉淀和Western blot分析：抗SOX4抗体免疫沉淀验证了SOX4与EBF2的物理结合。

ChIP实验：SOX4在Ucp1和Prdm16基因启动子区域显著占有率，表明直接转录调控。

FAIRE实验：Sox4-BKO小鼠在Ucp1和Prdm16启动子上游区域的DNA富集减少，影响染色质开放状态。

转录活性评估：SOX4和EBF2共同过表达显著增强Ucp1和Prdm16启动子的转录活性。

示意图模型：冷刺激或福司可林激活PKA，磷酸化SOX4促进核定位，与EBF2协同增强产热基因转录。

研究结论

1. SOX4对BAT发育和产热的重要性

SOX4是BAT发育和产热程序的必需因子。

Sox4-MKO和Sox4-BKO小鼠在冷暴露时出现BAT变白和体温过低。

2. Sox4-MKO小鼠的产热能力降低

Sox4-MKO小鼠产热能力下降，易受饮食诱导的肥胖影响。

3. SOX4过表达增强产热

BAT中过表达SOX4可增强产热，对抗饮食诱导的肥胖。

4. SOX4通过激活EBF2转录调控棕色脂肪命运

SOX4通过激活EBF2的转录决定棕色脂肪细胞的命运。

5. PKA磷酸化SOX4促进核内转移和EBF2转录

PKA在S235位点磷酸化SOX4，促进其核转位和EBF2的转录。

6. SOX4与EBF2合作激活产热基因转录程序

SOX4与EBF2共同激活调控产热基因表达的转录程序。