胶质瘤模型新突破：荧光素酶标记小鼠破解免疫排斥难题，AI技术精准量化肿瘤生长

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Optimization, Characterization, and Comparison of Two Luciferase-Expressing Mouse Glioblastoma Models

中文标题：两种荧光素酶表达小鼠胶质母细胞瘤模型的优化、表征与比较

发表期刊：《Cancers》

影响因子：4.5

作者单位：

1. Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

2. Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky

3. Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky

作者信息：

Louis T. Rodgers, Julia A. Schulz Pauly, Bryan J. Maloney, Anika M. S. Hartz, Björn Bauer

研究背景

胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性的脑癌，临床前研究依赖小鼠模型模拟人类肿瘤特征。荧光素酶标记的肿瘤细胞可通过生物发光成像(BLI)实时监测肿瘤生长和治疗反应，但近期研究发现荧光素酶基因可能引发免疫反应导致肿瘤排斥。本研究旨在优化两种荧光素酶标记的小鼠GBM模型(GL261 Red-FLuc和TRP-mCherry-FLuc)，验证其在免疫缺陷和免疫活性小鼠中的肿瘤植入效率，并通过组织病理学和MRI比较肿瘤特征，提出基于人工智能的高通量肿瘤体积分析方法。

研究方法

研究通过体外验证GL261 Red-FLuc和TRP-mCherry-FLuc细胞的荧光素酶活性(96孔板生物发光成像，0.15μg/孔荧光素)，确认细胞数量与发光强度呈线性关系(R²>0.93);随后在免疫活性(Albino B6)和免疫缺陷(J:NU)小鼠中立体定向颅内注射不同剂量肿瘤细胞(5×10³~5×10⁴)，每周通过生物发光成像(IVIS/Lago系统，150mg/kg荧光素腹腔注射)监测肿瘤生长，结合MRI(7T扫描仪，0.6mmol/kg钆对比剂)评估肿瘤体积及影像特征;终末期通过心脏灌注固定获取脑组织，进行H&E染色和抗荧光素酶免疫组化分析，利用HALO® AI平台训练深度学习模型自动分割肿瘤区域，对比人工与AI的肿瘤体积计算一致性，并通过广义线性混合模型(GLMM)和生存分析(Cox模型)统计肿瘤生长速率及生存差异。

实验结果

图1：体外荧光素酶活性验证

通过体外培养GL261 Red-FLuc和TRP-mCherry-FLuc细胞(5,000~20,000细胞/孔)，检测荧光素酶活性随时间(1~30分钟)的动态变化。结果显示，两种细胞系的生物发光强度与细胞数量呈显著线性相关(GL261 R²=0.985，TRP R²=0.932)，且发光信号在5分钟后趋于稳定，验证了荧光素酶标记的可靠性。GL261 Red-FLuc的峰值发光强度高于TRP，可能与红色荧光素酶(Red-FLuc)的光子穿透性优化有关，为后续体内成像提供基础数据。

图2：GL261在免疫活性小鼠中的低植入率与排斥反应

向Albino B6小鼠注射5×10⁴ GL261 Red-FLuc细胞后，仅38%(20/51)形成可追踪肿瘤，61%小鼠出现自发排斥(无肿瘤信号)。存活分析显示，成瘤小鼠中位生存期为27天，肿瘤倍增时间1.6天，但排斥组无肿瘤进展。组织学显示排斥脑组织中淋巴细胞浸润，提示荧光素酶引发T细胞介导的免疫清除，与Sanchez等报道一致，凸显该模型在免疫活性宿主的局限性。

图3：免疫缺陷小鼠中GL261的稳定成瘤与剂量依赖性生存

J:NU小鼠中所有注射剂量(5×10³~5×10⁴)均实现100%成瘤，肿瘤生长呈对数期(1~3周)，倍增时间2.1天，与细胞剂量无关(p>0.05)。存活分析显示，细胞数量与生存期负相关(50,000细胞组中位生存19天 vs. 5,000细胞组27天)，符合Logistic分布模型(AICc优选)，证明免疫缺陷环境消除宿主抗肿瘤免疫干扰，适用于治疗药物直接细胞毒性评估。

图4：TRP-mCherry-FLuc在免疫活性宿主的侵袭性生长

Albino B6小鼠中TRP-mCF细胞(5×10³~5×10⁴)成瘤率达100%(仅1例10,000细胞组排斥)，肿瘤倍增时间2.4天，中位生存期20~25天。MRI显示肿瘤占据同侧半球并侵袭对侧，H&E染色可见广泛坏死灶和血管共选现象，提示其侵袭性表型克服了荧光素酶相关免疫原性，为模拟人类GBM侵袭特性提供理想模型。

图5：MRI影像特征对比(GL261 vs. TRP)

GL261肿瘤在T1加权像呈边界清晰低信号，钆增强后不均匀强化，T2像显示瘤周水肿;TRP肿瘤则边界模糊，增强后中心无强化(提示坏死)，T2像见广泛浸润和占位效应。定量显示TRP体积(109.5±38.9mm³)显著大于GL261(28.9±18.8mm³，p<0.01)，与组织学侵袭性一致，凸显模型间病理差异。

图6：组织病理学特征对比

H&E染色显示，GL261肿瘤细胞密集排列，核异型性明显，血管增生显著;TRP肿瘤呈现坏死灶(嗜酸性无结构区域)和血管周围肿瘤细胞鞘(侵袭标志)。抗荧光素酶IHC证实GL261边界清晰，TRP边缘存在卫星灶，定量显示TRP血管侵袭评分显著高于GL261(p=0.005)，符合其侵袭表型。

图7：肿瘤有丝分裂、侵袭与坏死评分

GL261有丝分裂计数(5随机ROI/肿瘤)平均12.3±3.2，TRP为10.8±2.9(p=0.18);TRP血管侵袭评分(2.8±0.4 vs. GL261 1.2±0.3，p=0.005)和坏死评分(2.5±0.5 vs. 1.8±0.4，p=0.07)更高，反映其与人类GBM坏死和血管共选特征的相似性。

图8：AI与人工肿瘤体积分析对比

HALO® AI模型对GL261和TRP肿瘤分割的总体准确率>99%，体积计算与人工结果高度一致(GL261 R²=0.993，TRP R²=0.997)。AI误判主要源于坏死区(误分类为背景)或海马高细胞密度区(误判为肿瘤)，但差异无统计学意义(p=0.12)，证明AI可替代人工实现高通量分析。

图9：MRI与组织学体积差异

MRI高估肿瘤体积(GL261：28.9 vs. 组织学17.7mm³;TRP：109.5 vs. 64.4mm³)，差异源于瘤周水肿(T2高信号)或分辨率限制(MRI层厚400μm vs. 组织学4μm)。二者相关性较低(R²≈0.7)，提示跨模态数据需谨慎比较，但各自在纵向研究中具内部一致性。

研究结论

1.GL261 Red-FLuc在免疫活性小鼠中肿瘤植入率仅38%，需在免疫缺陷小鼠中实现100%植入;TRP-mCherry-FLuc在免疫活性小鼠中植入率高达100%。

2.GL261肿瘤表现为边界清晰、高血管化和高有丝分裂活性;TRP肿瘤呈侵袭性、坏死性和血管周围浸润特征。

3.基于AI的肿瘤体积分析与人工测量结果高度一致(R²>99%)，MRI与组织学体积存在差异(R²≈70%)。