淋巴结里的‘密谋’！免疫细胞联手Th1疗法竟能100%清除‘隐身肿瘤’，癌症治疗现曙光！

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：An Essential Role of Antigen-Presenting Cell/T-Helper Type 1 Cell-Cell Interactions in Draining Lymph Node during Complete Eradication of Class II-Negative Tumor Tissue by T-Helper Type 1 Cell Therapy

中文标题：抗原呈递细胞/Th1细胞在引流淋巴结中的相互作用对Th1细胞疗法完全清除MHC II类阴性肿瘤的关键作用

发表期刊：《Cancer Research》

影响因子：8.6

作者单位(前三位)：

Division of Immunoregulation, Section of Disease Control, Institute for Genetic Medicine, Hokkaido University, Sapporo, Japan

作者信息(前三位)：Kenji Chamoto, Daiko Wakita, Yoshinori Narita

研究背景

先前研究表明，过继转移卵清蛋白(OVA)特异性Th1细胞可完全清除表达MHC II类分子和OVA的肿瘤(如A20-OVA)，但对MHC II类阴性的肿瘤(如EG-7)无效。由于多数人类肿瘤不表达MHC II类分子，开发针对此类肿瘤的疗法至关重要。本研究旨在探索Th1细胞疗法结合瘤内注射抗原(OVA)能否诱导MHC II类阴性肿瘤的完全消退，并阐明引流淋巴结(DLN)在其中的作用。通过小鼠模型，研究者发现，单独Th1细胞治疗对EG-7肿瘤无效，但联合瘤内OVA注射可显著增强抗原呈递细胞(APC)向DLN的迁移，并促进Th1细胞与APC的相互作用，从而诱导肿瘤特异性CD8+ CTL的生成。研究进一步验证了DLN作为免疫应答起始器官的关键性。

研究方法

实验采用C57BL/6小鼠建立EG-7(MHC II类阴性OVA+肿瘤)模型。通过体外分化OVA特异性Th1细胞(来自OT-2或DO11.10 TCR转基因小鼠)，结合瘤内注射OVA蛋白进行治疗。CFSE标记Th1细胞追踪其体内迁移与增殖，Alexa荧光标记OVA检测APC迁移。流式细胞术分析DLN中CD11c+树突状细胞、CD11b+巨噬细胞及CD8+ T细胞的激活状态(如CD69表达)。通过H-2Kb OVA四聚体染色鉴定肿瘤特异性CTL，并通过51Cr释放实验评估CTL的细胞毒性。使用MHC II类缺陷小鼠和淋巴缺陷Aly/Aly小鼠验证DLN及APC/Th1相互作用的重要性。

实验结果

图1：联合疗法显著抑制EG-7肿瘤生长并诱导完全消退

图1通过对比不同治疗组(单独Th1、单独OVA、联合治疗)的肿瘤体积，显示联合治疗组(Th1+OVA)在小鼠中实现EG-7肿瘤的完全消退(图1C-H)。单独Th1或OVA仅轻微抑制肿瘤生长(图1F-G)，表明二者协同作用至关重要。组织学分析进一步显示，联合治疗组肿瘤组织内大量淋巴细胞浸润，提示免疫激活。此结果验证了Th1细胞需依赖外源抗原呈递(OVA)才能激活针对MHC II类阴性肿瘤的免疫应答。

图2：Th1细胞促进抗原负载APC向引流淋巴结迁移

通过瘤内注射Alexa F488标记的OVA，流式检测显示，联合治疗组(Th1+OVA)中CD11c+树突状细胞和CD11b+巨噬细胞携带荧光OVA从肿瘤迁移至DLN的数量显著增加(图2B-C)。单独OVA组APC迁移较少，提示Th1细胞通过分泌细胞因子(如IFN-γ)增强APC的迁移能力。此外，第二次治疗后DLN中APC数量进一步上升(图2C)，表明Th1细胞持续增强抗原呈递效率，为后续CTL生成提供基础。

图3：DLN是Th1细胞活化的初始场所

CFSE标记的Th1细胞在联合治疗后优先在DLN中增殖(图3B-D)，而远端淋巴结和脾脏中增殖较晚且程度较低(图3D)。免疫荧光显示，DLN中CFSE+ Th1细胞(绿色)与Alexa F594标记的OVA+ APC(红色)形成紧密接触(图3A)，表明MHC II类分子介导的APC/Th1互作驱动Th1活化。此结果揭示DLN作为免疫应答“启动中心”的重要性，远端器官的免疫激活可能依赖DLN的初始信号。

图4：联合疗法激活DLN中天然与获得性免疫细胞 

流式分析显示，联合治疗组DLN中NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞及CD8+ T细胞的CD69表达显著上调(图4)，提示天然免疫与获得性免疫的协同激活。CD8+ T细胞的CD69上调与后续OVA四聚体+ CTL的生成相关(图5)。对照组(单独Th1或OVA)中CD69表达无变化，表明Th1细胞需结合抗原呈递才能打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。

图5：DLN来源的OVA特异性CTL介导系统性抗肿瘤免疫

H-2Kb OVA四聚体染色显示，联合治疗组DLN和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中OVA特异性CD8+ CTL比例显著升高(图5A)。CTL对EG-7的杀伤活性通过51Cr释放实验验证，且可被OVA四聚体阻断(图5B)。CD8+ T细胞缺失实验(图5C)证实CTL是主要效应细胞。双侧肿瘤模型中，仅单侧注射OVA即可清除双侧肿瘤(图5C-b)，表明CTL具备系统性抗肿瘤能力。

图6：APC/Th1互作与DLN是CTL生成的必要条件

在MHC II类缺陷或Aly/Aly小鼠中，联合治疗无法诱导Th1细胞增殖(图6A-c,f)及OVA特异性CTL生成(图6A-g,i)。此结果直接证明，DLN中MHC II类分子介导的APC/Th1互作是抗肿瘤免疫的核心机制。淋巴缺陷小鼠的肿瘤持续生长进一步支持DLN作为免疫应答枢纽的不可替代性。

研究结论

Th1细胞联合瘤内OVA注射可完全清除已建立的EG-7肿瘤，而单独治疗无效。机制上，Th1细胞促进肿瘤内APC携带OVA迁移至DLN，并在DLN中与Th1细胞高效互作，激活其增殖(图3)。DLN中APC/Th1相互作用诱导OVA四聚体+ CTL的生成(图5)，这些CTL具有特异性杀伤EG-7的能力，并通过系统性免疫清除双侧肿瘤(图5C)。MHC II类缺陷或Aly/Aly小鼠中，Th1细胞增殖及CTL生成均被抑制(图6)，证明DLN及MHC II类分子介导的APC/Th1互作是抗肿瘤免疫的必要条件。研究还显示，DLN中NK、树突状细胞等天然免疫细胞的早期激活(CD69上调)与获得性免疫协同作用。