NanoLuc标记的柯萨奇病毒A16稳定感染细胞模型

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development and Characterization of a Stable Coxsackievirus A16 Infectious Clone with Nanoluc Reporter Gene.

中文标题：带有NanoLuc报告基因的柯萨奇病毒A16稳定感染克隆的开发和表征。

发表期刊：《Frontiers in Microbiology》

影响因子：4.0

作者单位：

1.Shanghai Public Health Clinical Center and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai, China.

2.Clinical Center for Biotherapy, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, China.

作者信息：

Rui Yu, Min Wang, Lizhen Liu, Jingjing Yan, Jun Fan, Xiaohong Li, Miaomiao Kang.

研究背景

柯萨奇病毒A16(CA16)是导致儿童手足口病(HFMD)的常见病原体之一，属于人类肠道病毒A种。目前，尚无针对CA16的特定疫苗和药物，因此深入了解病毒特性和开发有效治疗方法显得尤为重要。手足口病主要影响婴幼儿，通常为轻微且自限性疾病，但严重病例可能导致麻痹、心肌炎，甚至死亡。在亚太地区，CA16是仅次于EV71的HFMD常见病原。目前，只有针对EV71的灭活病毒疫苗上市，而对于包括CA16在内的其他肠道病毒尚无疫苗或药物。

报告病毒对于病毒学研究和小分子抗病毒药物的开发至关重要。尽管已有带有eGFP报告基因的CA16感染性克隆的报道，但eGFP在肠道病毒中通常不稳定，且难以进行高通量分析。NanoLuc荧光素酶(Nluc)作为一种新型荧光素酶，具有体积小、亮度高的特点，更适合高通量筛选。本研究成功构建了两个CA16感染性克隆(rCA16和rCA16-Nluc)，并对其进行了表征。研究发现，rCA16-Nluc中的Nluc基因在细胞培养中遗传稳定，且在十代培养后没有丢失报告基因。通过测量荧光强度，研究显示rCA16-Nluc的应用简化了抗病毒药物和中和抗体的测试，并且完全兼容高通量筛选平台，表明具有广阔的应用前景。

研究方法

本研究中，Vero细胞在DMEM中培养，CA16病毒株OP293089被分离。通过提取病毒RNA、反转录和PCR扩增构建了CA16感染性克隆(rCA16)和带有NanoLuc荧光素酶报告基因的克隆(rCA16-Nluc)。病毒mRNA通过体外转录生成，并转染到Vero细胞中。Western blot和免疫荧光测定用于检测病毒蛋白表达，而病毒滴度和抗病毒效果通过滴度测定和荧光素酶活性测量来评估。细胞活力通过CCK-8分析确定。动物实验涉及感染小鼠和评估病毒致病性。最后，基于荧光素酶的中和实验用于评估病毒中和抗体滴度。所有数据通过至少三次重复实验获得，并使用统计软件进行分析。

实验结果

图1：本研究成功构建并鉴定了完整的CA16感染性克隆rCA16，该克隆被插入含有T7启动子和锤头状核酶的pSVA载体中。

Vero细胞被pCA16和rCA16病毒感染后，观察到细胞病变效应，并在感染后24小时通过免疫印迹检测病毒2C蛋白。此外，研究还观察了pCA16和rCA16病毒在Vero细胞中的形态和病毒斑，以及使用抗3D抗体和Alexa Flour-488标记的二抗进行免疫荧光染色的结果。最后，通过一步生长曲线分析，发现pCA16和rCA16病毒在感染后24小时病毒RNA量达到峰值，且两种病毒的生长曲线无统计学差异。

图2：一周龄的哺乳小鼠通过腹腔注射接种了105 TCID50的pCA16和rCA16病毒，对照组小鼠则给予等体积的PBS。

研究观察了不同组小鼠体重的变化、感染后的生存曲线、感染后4天在大脑、心脏、肺和肌肉中的病毒RNA负荷，以及pCA16和rCA16感染引起的脑膜出血、肺泡壁增厚和大腿及心肌破裂等病理变化。统计差异通过t-test确定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

图3：在本研究中，我们构建并鉴定了带有NanoLuc荧光素酶报告基因的柯萨奇病毒A16(CA16)感染性克隆rCA16-Nluc。

首先，我们将Nluc基因和2A蛋白酶切割位点(AITTL)插入到rCA16感染性克隆中。Vero细胞感染rCA16和rCA16-Nluc后，24小时内观察到细胞病变效应(CPE)。通过免疫印迹检测，我们从感染的Vero细胞中检测到了病毒2C蛋白和β-微管蛋白。此外，我们还观察了rCA16和rCA16-Nluc病毒在Vero细胞中形成的病毒斑的形态。感染rCA16和rCA16-Nluc(MOI=1)6小时后，Vero细胞被固定并用抗3D抗体染色，随后使用Alexa Flour-488标记的二抗进行染色，DAPI用于核染色(绿色为2C蛋白;蓝色为核)。最后，我们分析了rCA16和rCA16-Nluc的一步生长曲线和相对发光强度(RLU)，病毒感染Vero细胞(MOI=0.1)后，在6、12、18、24、30和36小时后收获用于病毒RNA和RLU测量(实线表示病毒RNA的增长;虚线表示RLU的增长)。

图4：在本研究中，我们对rCA16-Nluc病毒中Nluc基因的稳定性进行了测试。

首先，我们通过一系列传代(从P0到P10)在Vero细胞中收集了rCA16-Nluc病毒，并测试了每个传代中的荧光素酶活性和Nluc基因存在情况。接着，我们通过感染不同传代的rCA16-Nluc病毒到Vero细胞，并测量了感染细胞的发光量(RLU值)和Nluc基因拷贝数。此外，我们通过RT-PCR扩增了rCA16-Nluc感染细胞的总RNA，并使用琼脂糖凝胶分析Nluc基因，结果显示从P0到P10的PCR产物均显示相同的预期大小，表明在连续传代过程中Nluc基因没有发生缺失。最后，通过Sanger测序不同传代的rCA16-Nluc病毒中的Nluc基因，我们确认了Nluc基因序列在P0到P10之间保持不变，从而证实了rCA16-Nluc病毒的遗传稳定性。这些结果表明，rCA16-Nluc病毒在Vero细胞中连续传代后，Nluc基因的插入是稳定的。

图5：本研究对GuHCl、利巴韦林、氯喹和NH4Cl四种药物基于rCA16-Nluc病毒进行了抗病毒效果测试。

Vero细胞在96孔板中过夜培养后，接种rCA16-Nluc病毒(MOI=0.1)，并进行药物处理。24小时后测量相对发光强度(RLU)。细胞活力通过CCK-8实验测定。实验结果包括不同浓度下药物的发光量、计算出的抑制率和细胞活力。具体来说，A、B组展示了GuHCl的发光量、抑制率和细胞活力;C、D组展示了利巴韦林的相应数据;E、F组展示了氯喹的相应数据;G、H组展示了NH4Cl的相应数据。统计差异通过t-test确定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

图6：本研究中，我们通过基于rCA16-Nluc的发光检测方法对柯萨奇病毒A16(CA16)中和抗体进行了测试。

首先，我们为小鼠制定了免疫程序，并分析了小鼠中的中和抗体(图6A)。接着，我们比较了传统的基于细胞病变效应(CPE-Nab)的中和抗体测试与基于荧光素酶的中和抗体测试(RLU-Nab)之间的相关性(图6B)。最后，我们测定了初次免疫后第二周和第四周小鼠血清中的中和抗体滴度(图6C)。统计差异通过t-test确定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

研究结论

本研究构建了CA16感染性克隆rCA16，并验证了其在Vero细胞中复制能力和毒力。rCA16-Nluc克隆成功表达NanoLuc荧光素酶，用于病毒复制和药物筛选。在小鼠模型中，rCA16显示出高致病性。rCA16-Nluc的稳定性在细胞传代中得到保持，适用于抗病毒药物和中和抗体的高通量筛选。