突破实体瘤免疫治疗瓶颈：类器官 + 外周血淋巴细胞共培养，高效诱导肿瘤反应性 T 细胞

研究背景

当前癌症免疫治疗(如 PD-1/PD-L1 抑制剂、过继性 T 细胞转移)虽对部分患者有效，但多数患者响应不佳，且缺乏个性化平台解析 T 细胞 - 肿瘤相互作用机制。传统上皮癌(如 CRC、NSCLC)原代细胞系建立成功率低(<10%)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)获取依赖手术标本，限制了临床转化。本研究通过肿瘤类器官(保留原发肿瘤组织学和突变特征，建立成功率 60%-90%)突破这一瓶颈。

来自荷兰癌症研究所的团队发表在《Cell》上题为Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids的文章，建立了一种个性化平台，通过自体肿瘤类器官与外周血淋巴细胞(PBL)共培养，从错配修复缺陷型结直肠癌(dMMR CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血中富集肿瘤反应性 T 细胞，并可评估肿瘤细胞对 T 细胞介导攻击的敏感性。

实验方法

1.肿瘤类器官的建立与鉴定：从 dMMR CRC 和 NSCLC 患者的手术切除标本或穿刺活检组织中获取肿瘤组织，机械 / 酶解后接种于基质胶(Geltrex)中，添加特定培养基扩增;通过全外显子测序(WES)验证突变负荷，流式细胞术检测 IFNγ 刺激后 MHC-I(肿瘤抗原呈递关键分子)和 PD-L1(免疫检查点分子)的表达。

2.外周血淋巴细胞(PBMC)分离与准备：通过密度梯度离心从患者外周血中分离 PBMC，冷冻保存;使用前解冻复苏，加入 IL-2 预处理过夜，为 T 细胞活化提供支持。

3.类器官与 PBMC 共培养诱导肿瘤反应性 T 细胞：肿瘤类器官经 IFNγ 预处理增强抗原呈递，与 PBMC 按 20:1(效应细胞：靶细胞)比例接种于抗 CD28 包被的培养板，添加 IL-2(支持增殖)和抗 PD-1 抗体(阻断免疫抑制);每周用新鲜类器官重刺激，共培养 2 周。

4.T 细胞反应性检测：通过流式细胞术分析 CD8+ T 细胞的 IFNγ 分泌(杀伤功能标志物)和 CD107a 表达(脱颗粒标志物)，评估肿瘤反应性 T 细胞比例。

5.肿瘤类器官杀伤实验：将诱导后的 T 细胞与自体肿瘤类器官共培养 3 天，通过流式细胞术(计数活细胞比例)和荧光成像(caspase 3/7 凋亡探针)，量化 T 细胞介导的肿瘤杀伤效率;添加 MHC-I/II 阻断抗体验证杀伤特异性。

关键结果

图 1：dMMR CRC 类器官的特征鉴定

成功建立 13 例患者来源的 15 个 dMMR CRC 类器官(建立成功率～60%)，形态与原发肿瘤高度一致;WES 显示中位突变负荷达 1938 个非同义突变(符合高突变肿瘤特征);62%(9/15)的类器官为 MHC-I 阳性(可有效呈递抗原)，且 MHC-I 表达与原发肿瘤组织高度相关(Spearman r=0.78);IFNγ 刺激后类器官 PD-L1 表达上调(免疫抑制相关)。

图 2：共培养诱导 dMMR CRC 患者循环 T 细胞的肿瘤反应性

在 8 例 MHC-I 阳性的 dMMR CRC 患者中，4 例(50%)经 2 周共培养后，CD8+ T 细胞出现显著的 IFNγ 分泌和 CD107a 上调，反应率从 1%-3% 到 50% 不等;其中 CRC-9 患者基线时即存在少量肿瘤反应性 T 细胞，共培养后扩增 10 倍，而 CRC-11/12/13 患者基线无检测到反应性 T 细胞，共培养后成功诱导出特异性反应。

图 3：共培养诱导 NSCLC 患者循环 T 细胞的肿瘤反应性

成功建立 6 例 NSCLC 患者来源的类器官(均为 MHC-I 阳性)，IFNγ 刺激后均表达不同水平的 PD-L1;2 例(33%)患者的 PBMC 经共培养后，CD8+ T 细胞出现明显的肿瘤反应性，且基线时未检测到该反应，证实共培养可诱导原本隐匿的肿瘤反应性 T 细胞。

图 4：类器官反应性 T 细胞的特异性验证

T 细胞反应不依赖 IFNγ 预处理(5 例中 4 例对未刺激类器官仍有反应);仅对诱导所用的自体肿瘤类器官产生反应，对自体正常组织类器官(结肠 / 肺)或错配修复正常型(pMMR)CRC 类器官无反应;3/4 测试样本的 T 细胞可识别自体肿瘤组织消化物，证实反应性针对肿瘤特异性抗原而非类器官培养相关抗原。

图 5：CD4+ T 细胞对异种组织培养成分的反应

部分 CD4+ T 细胞会对肿瘤类器官产生交叉反应，但该反应并非针对肿瘤抗原，而是源于类器官培养所用基质胶(Geltrex)中的鼠源抗原;去除 Geltrex 后，CD4+ T 细胞的交叉反应显著减弱，提示可通过合成基质替代 Geltrex 避免该问题。

图 6：自体肿瘤反应性 T 细胞可杀伤肿瘤类器官

共培养诱导的 T 细胞可显著降低肿瘤类器官的存活率(所有测试样本均有效);添加 MHC-I 阻断抗体可挽救肿瘤细胞存活，证实杀伤依赖抗原特异性 CD8+ T 细胞;荧光成像显示 T 细胞可诱导肿瘤类器官凋亡，且对自体正常组织类器官无杀伤作用，验证了杀伤特异性。

全文总结

本研究首次建立了适用于上皮癌(dMMR CRC、NSCLC)的个性化 T 细胞 - 肿瘤相互作用研究平台，通过肿瘤类器官与外周血淋巴细胞共培养，无需手术标本即可高效诱导肿瘤反应性 T 细胞，同时实现对肿瘤细胞 T 细胞敏感性的个体化评估。该平台解决了传统方法中上皮癌原代细胞系建立难、TIL 获取受限的问题，具有两大核心价值：一是为解析免疫治疗响应 / 耐药机制提供工具(如复发患者的耐药原因分析、联合治疗药物筛选);二是为过继性 T 细胞治疗提供新策略(从外周血富集 T 细胞，无需依赖 TIL)。未来需扩大样本量验证成功率，并探索对低突变负荷肿瘤(如 pMMR CRC)的适用性，有望推动精准免疫治疗从 “群体有效” 走向 “个体适配”。