GLP-1R 信号激活促进高氧暴露新生大鼠肺发育：线粒体代谢与 m6A 甲基化调控机制

胰高血糖素样肽-1 受体(GLP-1R)在调节血糖稳态中具有重要作用，且在肺等多个器官中均有分布。已有研究报道GLP-1R在急慢性肺部疾病中的作用，但对肺发育的影响及机制尚不明确。

由中国医科大学盛京医院的团队在《Redox Biology》期刊上发表的题为Glucagon-like peptide-1 receptor signaling activation in alveolar type II cells enhances lung development in neonatal rats exposed to hyperoxia的研究，揭示了 GLP-1R 在 II 型肺泡上皮细胞(ATII 细胞)中通过调控线粒体分裂和糖代谢促进肺发育，且高氧通过抑制 m6A 甲基化下调 GLP-1R 表达，进而加剧支气管肺发育不良(BPD)的分子机制，为新生儿 BPD 的治疗提供了新靶点。

摘要

GLP-1R 属于 G 蛋白偶联膜受体，除胰腺外，在肺组织中高表达，已被证实参与哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等肺部疾病的调控，但其在肺发育中的作用尚未明确。支气管肺发育不良(BPD)是早产儿最常见的呼吸系统并发症之一，以肺泡结构简化和肺血管发育不良为特征，发病机制复杂，涉及氧化应激、炎症、代谢失调等多个方面，ATII 细胞损伤是 BPD 的病理基础。ATII 细胞在肺泡分泌、再生、分化及维持肺稳态中具有重要功能，团队前期转录组结果显示 BPD 动物模型肺组织中 GLP-1R 基因表达显著下调，但 GLP-1R 信号在 BPD 发病机制中的作用及上游调控机制仍需深入探究。本研究旨在明确 GLP-1R 对肺发育的影响及其在 BPD 发病中的作用，为 BPD 的防治提供新的理论依据。

实验方法

1.GLP-1R 的表达特征验证：构建高氧(FiO₂=0.85)诱导的新生大鼠 BPD 模型和 RLE-6TN 细胞(大鼠 ATII 细胞)高氧模型，通过 Western blot、RT-qPCR 检测 GLP-1R 在肺组织、原代 ATII 细胞和 RLE-6TN 细胞中的表达水平;利用免疫荧光共染色验证 GLP-1R 与 ATII 细胞标志物 SPC 的共定位;通过 HE 染色观察肺组织形态学变化，计算肺泡径向计数(RAC)和肺泡壁厚度评估肺发育情况。

2.GLP-1R 的功能验证：通过腺病毒介导的 GLP-1R 敲低或过表达，在体内外验证 GLP-1R 对肺发育的影响;利用 CCK-8 法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率;通过 ELISA 检测肺发育相关因子(TGF-β1、VEGF-A、BMP4)的分泌水平;采用单细胞 RNA 测序明确 GLP-1R 在肺组织不同细胞群中的作用靶点。

3.分子机制解析：通过 Seahorse XF96 代谢分析仪检测细胞外酸化率(ECAR)和氧消耗率(OCR)，评估糖酵解和线粒体氧化磷酸化水平;利用 MitoTracker 染色观察线粒体形态，Western blot 检测线粒体分裂相关蛋白(DRP1)和糖酵解相关酶(PFKM、HK2、LDHA)的表达;通过 MeRIP-qPCR 检测 GLP-1R mRNA 的 m6A 修饰水平;利用双荧光素酶报告基因实验验证 m6A 修饰位点及关键甲基转移酶;通过 siRNA 敲低甲基转移酶(METTL3、METTL14 等)，验证其对 GLP-1R 表达的调控作用。

关键结果

图1：高氧暴露下调 GLP-1R 表达并抑制肺发育

该图验证了高氧对 GLP-1R 表达和肺发育的影响：差异基因分析显示，GLP-1R 是出生后 1、3、7、10、14 天持续差异表达的基因之一，且在 BPD 模型中表达逐渐下调;高氧组新生大鼠肺组织中 GLP-1R 的 mRNA 和蛋白水平在 3、7、10、14 天均显著低于对照组;HE 染色显示，高氧组肺泡数量减少、肺泡腔直径增大、肺泡结构简化，肺泡壁厚度逐渐增厚，RAC 值降低，证实高氧暴露抑制肺发育，且 GLP-1R 信号通路抑制可能与肺发育延迟相关。

图2：GLP-1R 在肺发育中呈动态表达且促进肺发育

该图明确了 GLP-1R 在肺发育中的表达规律和功能：对照组新生大鼠肺组织中，GLP-1R 蛋白水平在出生后 5-11 天显著下调，11 天后逐渐升高;GLP-1R 敲低后，肺组织肺泡结构简化、肺泡壁增厚、RAC 值降低，肺发育相关因子(TGF-β1、VEGF-A、BMP4)分泌减少;胎肺组织中，GLP-1R 在出生后表达明显上调，证实 GLP-1R 在出生后肺发育中具有重要作用。

图3：单细胞测序证实 GLP-1R 主要在 ATII 细胞中发挥作用

该图通过单细胞测序明确了 GLP-1R 的作用靶点：对照组和 GLP-1R 敲低组肺组织中共鉴定出 15 种不同细胞类型，GLP-1R 敲低后上皮细胞比例从 14.8% 降至 9.7%;上皮细胞亚群分析显示，ATII 细胞比例从 25.8% 降至 19.2%，且 GLP-1R 基因在 ATII 细胞中表达变化最为显著;GLP-1R 敲低后，ATII 细胞中肺发育关键基因(BMP4、WNT4、VEGF-A 等)表达下调，细胞凋亡率升高，增殖能力降低，证实 GLP-1R 主要通过调控 ATII 细胞功能促进肺发育。

图4：高氧暴露抑制 ATII 细胞中 GLP-1R 表达

该图验证了高氧对 ATII 细胞中 GLP-1R 的调控作用：高氧组原代 ATII 细胞中，GLP-1R 的 mRNA 和蛋白水平显著低于对照组;免疫荧光共染色显示，GLP-1R 与 SPC 在肺组织切片和原代 ATII 细胞中均存在共定位，且高氧组 GLP-1R 荧光强度随时间逐渐减弱，证实高氧暴露特异性下调 ATII 细胞中 GLP-1R 表达。

图5：GLP-1R 过表达促进高氧暴露大鼠肺发育

该图验证了 GLP-1R 过表达的体内保护作用：HE 染色显示，高氧组肺组织肺泡结构简化，而 GLP-1R 过表达组肺泡结构明显改善，肺泡壁厚度降低，RAC 值升高;ELISA 结果显示，高氧组肺发育相关因子(TGF-β1、VEGF-A、BMP4)分泌减少，GLP-1R 过表达可显著恢复其分泌水平;流式细胞术和 CCK-8 实验证实，GLP-1R 过表达可降低高氧诱导的 ATII 细胞凋亡，提高细胞增殖能力。

图6：GLP-1R 通过调控线粒体分裂和糖代谢促进肺发育

该图解析了 GLP-1R 的下游分子机制：高氧组原代 ATII 细胞中 ATP 水平显著降低，GLP-1R 过表达可恢复 ATP 生成;Seahorse 分析显示，高氧组 ECAR 值升高(糖酵解增强)，OCR 值降低(线粒体氧化磷酸化减弱)，GLP-1R 过表达可逆转这一效应;MitoTracker 染色显示，高氧组线粒体从长管状变为短碎片状，GLP-1R 过表达可改善线粒体碎片化;Western blot 结果显示，高氧组线粒体分裂相关蛋白 DRP1 和糖酵解相关酶(PFKM、HK2、LDHA)表达上调，GLP-1R 过表达可显著下调其表达，证实 GLP-1R 通过抑制 DRP1 介导的线粒体分裂和糖酵解，促进线粒体氧化磷酸化，进而促进肺发育。

图7：高氧通过抑制 m6A 甲基化下调 GLP-1R 表达

该图揭示了 GLP-1R 的上游调控机制：高氧组 RLE-6TN 细胞中，GLP-1R mRNA 水平在 24、48、72 小时均显著降低;MeRIP-qPCR 证实，GLP-1R mRNA 的 m6A 修饰水平在高氧组显著降低，修饰位点位于 3'UTR 区域;高氧组 m6A 甲基转移酶(METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA)表达下调，其中 METTL14 降低最为显著;siRNA 敲低 METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA 后，GLP-1R mRNA 水平显著降低;双荧光素酶报告基因实验证实，METTL14 可通过调控 GLP-1R mRNA 的 m6A 修饰影响其表达，突变 m6A 位点后，METTL14 的调控作用消失。

全文总结

本研究系统阐明了 GLP-1R 在肺发育中的作用及机制：GLP-1R 主要在新生大鼠 ATII 细胞中表达，出生后呈动态变化，通过抑制 DRP1 介导的线粒体分裂和糖酵解，促进线粒体氧化磷酸化和 ATP 生成，进而促进肺发育;高氧暴露可显著下调 ATII 细胞中 GLP-1R 的 mRNA 和蛋白水平，加剧肺泡结构简化和肺发育延迟，最终导致 BPD;机制上，高氧通过抑制 m6A 甲基转移酶 METTL14 的表达，降低 GLP-1R mRNA 的 m6A 修饰水平，进而下调 GLP-1R 表达。该研究不仅明确了 GLP-1R 在肺发育中的关键作用，还揭示了 m6A 甲基化对 GLP-1R 的调控机制，为新生儿 BPD 的治疗提供了新的靶点(GLP-1R、METTL14)和策略，未来可通过激活 GLP-1R 信号或调控 m6A 甲基化改善高氧诱导的肺发育损伤，为 BPD 的临床防治提供新的思路。