新型线性帽非依赖 mRNA 疫苗：自带佐剂活性，激活强效抗肿瘤免疫

mRNA 疫苗凭借快速开发、高免疫原性和良好安全性，已成为癌症免疫治疗的核心方向之一，个性化 mRNA 疫苗联合免疫检查点抑制剂在黑色素瘤、胰腺癌等癌症中取得了积极的临床结果。但现有 mRNA 疫苗平台存在明显局限：传统线性 mRNA 需 5’加帽和核苷酸修饰才能保证稳定性和翻译效率，增加了生产复杂度;环状 RNA(circRNA)生产流程繁琐、成本高昂;自扩增 mRNA(saRNA)易产生双链 RNA(dsRNA)，引发系统性炎症反应。此外，多数 mRNA 疫苗缺乏内在佐剂活性，需额外添加佐剂才能激活足够的免疫响应。

由复旦大学附属肿瘤医院、福建医科大学附属肿瘤医院的团队发表在《Nature Communications》的研究：An engineered linear cap-independent mRNA vaccine with intrinsic adjuvanticity induces potent anti-tumor immunity in mice，团队通过融合病毒来源的外切核酸酶抗性元件与 RNA 结合蛋白 motif，构建了无需 5’加帽和核苷酸修饰的线性帽非依赖 mRNA(LciRNA)疫苗平台，该疫苗兼具高稳定性、高效翻译效率和内在佐剂活性，在小鼠肿瘤模型中实现了强效抗肿瘤免疫响应。

实验方法

1.核心元件筛选与优化：从 5 种黄病毒(登革热病毒、寨卡病毒等)的亚基因组 RNA(sfRNA)中筛选外切核酸酶抗性元件(xrRNA)，通过荧光素酶报告基因筛选出最优的 UX1 元件(来源于 Usutu 病毒);在 UX1 下游融合多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)结合基序，形成 UPA 保护序列;搭配优化的肠道病毒 A(EV-A)内部核糖体进入位点(IRES)，构建基础 LciRNA 框架;进一步筛选人类 β- 珠蛋白来源的 5’和 3’非翻译区(UTR)，优化翻译效率。

2.LciRNA 疫苗构建与制备：将目标抗原基因(OVA、HPV E6/E7)插入 LciRNA 框架，通过体外转录合成 LciRNA(无需添加帽类似物或修饰核苷酸);同时制备传统加帽 mRNA(CAP)和 m1Ψ 修饰的加帽 mRNA(mCAP)作为对照;将各类 mRNA 封装于 SM102 脂质纳米颗粒(LNP)中，用于体内外实验。

3.体外功能与机制验证：通过荧光素酶报告基因实验验证 LciRNA 的稳定性和翻译效率;利用 XRN-1 外切核酸酶消化实验明确 UPA 序列的抗降解作用;通过 RNA pull-down、质谱分析和 RNA 免疫沉淀(RIP)鉴定与 UPA 结合的 RNA 结合蛋白(RBP);刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)，通过 qRT-PCR 和 RNA-seq 分析其免疫激活能力。

4.体内疗效与安全性评估：在 B16F10-OVA 黑色素瘤和 HPV 相关 TC-1 肿瘤小鼠模型中，评估 LciRNA 疫苗的抗肿瘤效果;通过流式细胞术分析外周血、脾脏和肿瘤组织中的抗原特异性 T 细胞响应;监测小鼠体重、血清转氨酶水平和器官组织病理学变化，评估疫苗安全性。

关键结果

图1：LciRNA 疫苗的设计与核心元件优化

该图呈现了 LciRNA 的结构设计与关键元件筛选过程：LciRNA 的 5’端融合黄病毒 sfRNA 来源的 xrRNA 元件和 PABP 结合基序(UPA 序列)，中间为 EV-A-S1 IRES，下游为目标抗原基因和 3’UTR 及 poly (A) 尾，无需 5’加帽即可启动翻译。通过荧光素酶报告基因筛选，从 18 种候选 xrRNA 元件中鉴定出 UX1(Usutu 病毒来源)具有最强的表达增强效果;进一步优化发现，在 UX1 和 IRES 之间插入 PABP 基序，搭配人类 β- 珠蛋白的 5’和 3’UTR，可显著提升 LciRNA 的翻译效率，为后续疫苗构建奠定了基础。

图2：LciRNA 的稳定性与体内表达优势

该图验证了 LciRNA 的稳定性及与传统 mRNA 的表达差异：核苷酸修饰(m6A、m1Ψ 等)会破坏 UX1 和 IRES 的结构，导致 LciRNA 表达下降，表明 LciRNA 无需修饰即可高效表达;对 UX1 的伪结结构进行突变后，其抗降解能力显著减弱，证实天然 UX1 序列已达到最优抗降解效果。体内外稳定性实验显示，含双 UPA 序列(2UPA)的 LciRNA 在细胞中可维持 5 天稳定表达，与加帽 mRNA 相当;在小鼠体内，2UPA-LciRNA 的生物发光信号在 48 小时后超过 m1Ψ 修饰的加帽 mRNA(mCAP)，且持续至 120 小时，表明其体内稳定性更优，为长效抗原表达和免疫激活提供了保障。

图3：UPA 序列通过抑制 XRN-1 降解和结合 RBP 增强 LciRNA 稳定性

该图揭示了 LciRNA 的稳定性机制：体外 XRN-1 消化实验显示，未受保护的 RNA 在 2 小时内完全降解，而 UPA-LciRNA 和 2UPA-LciRNA 与加帽 mRNA 类似，能有效抵抗 XRN-1 介导的外切核酸酶降解，且 2UPA 的保护效果优于单 UPA。通过 RNA pull-down 结合质谱分析，鉴定出 6 种与 UPA 序列特异性结合的 RNA 结合蛋白(RBP)，包括 PABPC1、IGF2BP1、YBX1 等已知的 mRNA 稳定蛋白;siRNA 敲低实验证实，敲低 IGF2BP1 或 YBX1 会特异性降低 LciRNA 的表达，而对加帽 mRNA 无影响，表明 UPA 序列通过 “抑制 XRN-1 降解 + 招募稳定型 RBP” 双重机制，实现了无需加帽的高稳定性。

图4：LciRNA 具有内在佐剂活性，可激活 DC 成熟且安全性良好

该图展示了 LciRNA 的免疫激活能力与安全性：刺激小鼠 BMDC 后，LciRNA(UPA-Fluc、2UPA-Fluc)能显著上调 MHC-I、CD40、CD80 等共刺激分子的表达，以及 IFN-α、IFN-β、IL-6 等促炎细胞因子的分泌，其激活效果显著强于传统加帽 mRNA(CAP-Fluc、mCAP-Fluc);RNA-seq 分析显示，LciRNA 强烈激活了模式识别受体(PRR)信号通路、抗原加工呈递通路和 I 型干扰素响应通路，证实其通过多 PRR engagement 发挥内在佐剂作用。安全性评估显示，LciRNA 疫苗接种后，小鼠体重无明显变化，血清转氨酶(ALT、AST)水平与对照组相当，主要器官无病理损伤，表明其在有效剂量下具有良好的生物安全性。

图5：LciRNA 疫苗在黑色素瘤模型中诱导强效抗肿瘤 T 细胞响应

该图验证了 LciRNA 疫苗在 B16F10-OVA 黑色素瘤模型中的治疗效果：接种 2UPA-OVA LciRNA 疫苗的小鼠，肿瘤生长受到显著抑制，21 天内 3/6 的小鼠实现完全肿瘤消退，疗效优于传统加帽 mRNA 疫苗。流式细胞术分析显示，2UPA-OVA 疫苗诱导的 OVA 特异性 CD8+ T 细胞比例(32.6%)显著高于 UPA-OVA(25.3%)和 mCAP-OVA(23.2%);肿瘤浸润淋巴细胞分析显示，LciRNA 疫苗组的 CD4 + 和 CD8+ T 细胞浸润数量显著增加，且 OVA 特异性 CD8+ T 细胞比例更高，表明 LciRNA 疫苗能有效将 “冷肿瘤” 转化为 “热肿瘤”，增强肿瘤局部免疫响应。

图6：LciRNA 疫苗有效清除 HPV 相关肿瘤并诱导长效免疫记忆

该图展示了 LciRNA 疫苗在 HPV 相关肿瘤模型中的治疗效果：针对 HPV E6/E7 抗原的 2UPA-E6E7 LciRNA 疫苗，在 TC-1 肿瘤小鼠模型中实现了持续的肿瘤消退，所有接种小鼠在 40 天观察期内均无复发，而传统加帽 mRNA 疫苗组有部分小鼠出现肿瘤复发。免疫分析显示，2UPA-E6E7 疫苗诱导的 E6/E7 特异性 IFN-γ+ CD8+ T 细胞比例(17.0%)显著高于加帽 mRNA 组;40 天后脾脏中仍能检测到高比例的抗原特异性 CD8+ T 细胞，表明 LciRNA 疫苗能诱导长效肿瘤特异性免疫记忆，为预防肿瘤复发提供了保障。

图7：LciRNA 疫苗激活抗肿瘤免疫的分子机制示意图

该图总结了 LciRNA 疫苗的作用机制：LciRNA 被树突状细胞(DC)摄取后，其 5’三磷酸基团、病毒来源的 IRES 结构及 UPA 序列分别被 RIG-I、PKR、TLR 等模式识别受体识别，激活 NF-κB 和 IRF3 信号通路，促进 I 型干扰素和促炎细胞因子(IL-6、IL-12 等)分泌;同时，LciRNA 的高稳定性保证了抗原的持续表达和呈递，DC 表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)表达上调;最终，DC 通过 “抗原呈递 + 共刺激信号 + 细胞因子” 三重信号，高效激活肿瘤特异性 CD4 + 和 CD8+ T 细胞，增强外周免疫响应和肿瘤浸润，实现肿瘤清除和长期免疫记忆。

全文总结

本研究通过序列工程构建了无需 5’加帽和核苷酸修饰的 LciRNA 疫苗平台，该平台融合黄病毒来源的 UX1 外切核酸酶抗性元件与 PABP 结合基序，形成 UPA 保护序列，搭配优化的 EV-A IRES，实现了高效翻译和高稳定性;同时，LciRNA 通过多模式识别受体激活，具有内在佐剂活性，可促进 DC 成熟和促炎因子分泌，无需额外添加佐剂。在小鼠黑色素瘤和 HPV 相关肿瘤模型中，LciRNA 疫苗展现出优于传统加帽 mRNA 疫苗的抗肿瘤效果，能诱导强效、长效的肿瘤特异性 T 细胞响应和免疫记忆，且安全性良好。该研究解决了现有 mRNA 疫苗平台 “疗效依赖复杂修饰或佐剂” 的核心痛点，提供了一种低成本、高疗效、易生产的癌症疫苗设计方案，为 mRNA 疫苗的临床转化和广泛应用奠定了基础。未来需进一步开展大动物实验和临床试验，验证 LciRNA 疫苗的长期安全性和临床疗效，同时优化元件组合以提升其在不同癌症类型中的适用性。