VSX2 阳性视网膜祖细胞的动态分子与细胞特征：为视网膜退行性疾病细胞治疗奠基

视网膜退行性疾病(RDs，如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性)因感光细胞丢失导致失明，全球数百万患者缺乏有效治疗手段。人视网膜祖细胞(RPCs) 因具备自我更新及分化为所有视网膜细胞的能力，是 RDs 细胞治疗的理想供体细胞，但存在两大瓶颈：一是人胎儿视网膜来源的 RPCs 伦理争议大、数量有限;二是缺乏特异性细胞表面标志物，难以高效分选纯净 RPCs(传统动物来源标志物如 CD24、KIT 在人类中不特异)。

中山大学的团队 在《Stem Cell Research & Therapy》上发表题为Dynamic molecular and cellular characteristics of VSX2-positive retinal progenitor cells in human retinal organoids的研究，利用 VSX2 增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因人诱导多能干细胞(hiPSC)系，构建视网膜类器官(ROs)，追踪 VSX2⁺RPCs 的时空动态，通过转录组分析揭示其异质性，并首次筛选出 394 个 CD 标志物的动态表达，发现TNFRSF1B为早期 RPCs 的新候选表面标志物，为 RPCs 的临床转化奠定基础。

实验方法

hiPSC 培养与视网膜类器官(ROs)构建：采用 4 株 hiPSC(BC1、VSX2-eGFP、BRN3B-GFP、UC3X18)，在 Matrigel 包被板上用 mTeSR1 培养基维持 pluripotency;ROs 分化按已发表 protocol 进行：hiPSCs 诱导至 D12 形成眼场样结构(EFs)，D14-D30 发育为视杯样结构(OCs，含神经视网膜 NR 与视网膜色素上皮 RPE)，D30 后手动剥离 OCs 形成 ROs，培养至 D225，定期观察 VSX2-eGFP 荧光。

VSX2-eGFP 报告基因验证与细胞分选：通过免疫荧光(抗 VSX2 抗体)验证 eGFP 与内源性 VSX2 的共定位;在 D28(极早期)、D55(早期)、D118(中期)、D170(晚期)用木瓜蛋白酶解离 ROs 的 NR，通过荧光激活细胞分选(FACS)分离 VSX2-eGFP⁺/⁻细胞，分选缓冲液为含 1mM EDTA 和 2% FBS 的 PBS，4℃分选。

转录组分析与标志物筛选：对分选细胞进行 bulk RNA-seq(Illumina NovaSeq 6000)，用 HISAT2 比对基因组，StringTie 组装转录本，DESeq2 分析差异表达基因(DEGs，FDR<0.05、|FC|≥2)，GSEA 分析通路富集;重点分析 394 个人类 CD 标志物的动态表达，结合 FPKM 值(>5 为高表达)与免疫荧光 / 流式验证候选标志物。

免疫荧光与流式细胞术验证：ROs 或分选细胞固定后，用 RPC 标志物(RAX、SOX9、PAX6)、增殖标志物(Ki67、MCM2)、双极细胞标志物(PKCα)及候选 CD 标志物(TNFRSF1B)的抗体染色，共聚焦显微镜观察;流式细胞术(LSRFortessa)量化 TNFRSF1B 与 VSX2/Ki67 的共表达率。

关键结果

图1：VSX2-eGFP 报告基因的时空表达与可靠性验证

该图证实 VSX2-eGFP 可忠实反映内源性 VSX2 表达：(A)RT-qPCR 显示 VSX2-eGFP hiPSC 与亲本 BC1 hiPSC 的多能性基因(OCT4、NANOG)表达一致;(B)D60 ROs 的转录组相关性(Pearson 系数 0.997)，视网膜谱系基因(VSX2、RAX、LHX2)表达无差异，排除基因编辑的负面影响;(C-D)荧光观察显示：D12-D14 eGFP 在 EFs 中首次出现，D14-D30 在 OCs 的中央 NR 区特异性表达(RPE 无表达)，D30 后 ROs 的 NR 层持续表达，D90-D225 荧光密度逐渐降低;(E)免疫荧光证实 eGFP 与内源性 VSX2 共定位，仅 D55 NR 最内层有短暂 eGFP 信号(可能因荧光蛋白稳定性高于内源蛋白)，随成熟消失，验证报告基因的可靠性。

图2-4：VSX2-eGFP⁺细胞的阶段特异性特征(极早期→晚期)

图2(极早期，D28)：VSX2-eGFP⁺细胞含 245 个特异表达基因(SEGs)，1735 个 DEGs，高表达 RPC 标志物(VSX2、RAX、HES1)，低表达脑发育基因(FOXG1、SOX1)与 RPE 基因(OTX2、BEST1);免疫荧光显示 D16 EF 中 eGFP⁺细胞 90% 以上表达 RAX，不表达 SOX1/OTX2，证实为 RPCs。

图3(早期，D55)：eGFP⁺细胞含 548 个 SEGs，3550 个 DEGs，高表达 RPC 基因(SOX9、SOX2)与增殖基因(MKI67、PCNA)，低表达视网膜神经节细胞(ATOH7)与感光细胞(CRX)基因;免疫荧光显示 eGFP⁺细胞 85% 以上表达 MCM2/Ki67(增殖)与 RAX/SOX9(RPC)，为增殖型 RPCs。

图4(晚期，D170)：eGFP⁺细胞含 784 个 SEGs，4182 个 DEGs，高表达双极细胞基因(PCP2、VSX1)与 Müller 胶质细胞基因(GLUL)，低表达感光细胞 / 无长突细胞基因;免疫荧光显示 eGFP⁺细胞位于 NR 的内核层，不表达 Ki67/RAX，90% 以上表达双极细胞标志物 PKCα，证实分化为双极细胞。

图5：VSX2-eGFP⁺细胞的转录组异质性

该图揭示 RPCs 的阶段特异性转录差异：(A)VSX2 在 D28-D118 表达稳定，D170 显著降低;(B)各阶段 SEGs 不同：D28 富集 LIN28A(干细胞相关)，D55 富集 ONECUT1(早期细胞命运)，D118 富集 PRDM13(神经发生)，D170 富集 SLC4A10(双极细胞功能);(C-F)DEGs 与通路分析：D55 vs D28 富集细胞周期 / DNA 复制通路，D118 vs D55 富集光传导 / 谷氨酸突触通路，D170 vs D118 富集突触囊泡循环通路;(G)细胞命运基因动态：D28-D55 高表达早期细胞(神经节细胞、无长突细胞)基因，D55 后高表达晚期细胞(视杆、双极细胞)基因，反映 RPCs 分化潜能的时空变化。

图6：CD 标志物筛选与 TNFRSF1B 的鉴定

该图首次解析 394 个 CD 标志物的动态表达并发现新 RPC 标志物：(A)127 个差异表达 CD 标志物(DECDGs)分阶段富集：D28 富集增殖 / 迁移相关(CD24、TNFRSF1B)，D55 富集形态发生相关(IFITM1)，D118 富集神经发生相关(NCAM1)，D170 富集整合素家族(ITGA1/2);(B)D28/D55 eGFP⁺细胞中，TNFRSF1B 显著上调(FPKM>5)，而传统动物来源标志物(CD24、FUT4、CD44、KIT)无特异性(CD24 在 eGFP⁻细胞也高表达，KIT 在神经节细胞中也存在);(C-G)验证：免疫荧光显示 TNFRSF1B 与 eGFP⁺细胞共定位(D32)，D35-D55 NR 中高表达，D75 后降低;流式显示 D55 NR 中 92±5% VSX2⁺细胞、86±7% Ki67⁺细胞表达 TNFRSF1B，证实其为早期 RPCs 的候选标志物。

全文总结

本研究的核心贡献的在于：1)模型创新：建立 VSX2-eGFP 报告基因 hiPSC-RO 系统，首次实现人类 RPCs 的时空动态追踪，验证其可忠实反映内源性 VSX2 表达;2)机制发现：揭示 VSX2⁺细胞的阶段特异性特征 —— 极早期 / 早期为增殖型 RPCs，晚期分化为双极细胞，且存在显著转录异质性，为选择移植用 RPCs(推荐 D28-D55)提供依据;3)标志物突破：首次系统分析 394 个 CD 标志物的动态表达，发现 TNFRSF1B 为早期 RPCs 的新特异性标志物(传统标志物如 CD24/KIT 无特异性)，流式验证共表达率超 90%，解决 RPCs 分选难题。

局限性在于：D55 NR 最内层存在短暂 eGFP 信号，可能轻微影响分选纯度;未来需结合单细胞 RNA-seq 细化 RPC 亚群，并用 TNFRSF1B 分选 RPCs 验证移植疗效。该研究为视网膜发育研究与 RDs 细胞治疗提供关键工具与理论基础。