CRISPR 新技术实现肺癌 EGFR 突变低成本可视化检测

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：CRISPR‑Based Fluorescent Reporter (CBFR) Assay for Sensitive, Specific, Inexpensive, and Visual Detection of a Specific EGFR Exon 19 Deletion in NSCLC

中文标题：基于 CRISPR 的荧光报告基因(CBFR)检测法用于非小细胞肺癌中特定 EGFR 19 号外显子缺失的灵敏、特异、低成本可视化检测

发表期刊：《Molecular Biotechnology》

影响因子：2.5

作者单位：

1.Department of Medical Genetics, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

2.Department of Genetics, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

3.Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

作者信息：

第一作者：Pouya Salehipour

通讯作者：Mohammad Hossein Modarressi

研究背景

EGFR 是具有胞内酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，其 19 号外显子缺失、21 号外显子 L858R 突变是非小细胞肺癌对酪氨酸激酶抑制剂敏感的关键突变，其中 delE746_A750 是 19 号外显子缺失最常见亚型;传统 PCR 测序、实时荧光 PCR 等检测方法灵敏度不足，数字 PCR 与二代测序虽灵敏却耗时昂贵，而 CRISPR-Cas12a 的非特异性反式切割活性为高灵敏、快速核酸检测提供了新方向，因此亟需开发适配基层实验室的低成本、可视化 EGFR 突变检测技术。

研究方法

该研究通过生物信息学工具设计靶向 EGFR 19 号外显子 delE746_A750 缺失的特异性引物与 gRNA，提取非小细胞肺癌 FFPE 临床样本的基因组 DNA 并完成 PCR 扩增，构建不同突变型 / 野生型比例的梯度样本，优化荧光报告分子浓度、PCR 产物加入量等反应体系，利用 CRISPR-Cas12a 介导的荧光报告切割反应，通过实时荧光 PCR 仪、蓝光检测仪与紫外凝胶成像系统完成检测信号的读取、灵敏度与特异性验证。

实验结果

图 1 CBFR 检测法检测 EGFR 19 号外显子缺失的原理示意图

该图清晰呈现 CBFR 检测法的两步核心流程，先经 PCR 扩增 EGFR 19 号外显子靶区域，若样本存在目标缺失突变，Cas12a-gRNA 复合物识别靶序列后激活反式切割活性，降解荧光报告分子释放荧光信号，在蓝光检测仪下呈绿色;野生型样本无靶序列识别，Cas12a 未激活，报告分子不被切割，无荧光显色，实现突变的直观可视化区分。

图 2 CBFR 检测法的灵敏度分析(未优化体系)

未优化的 CBFR 体系(2μM 荧光报告分子、2μL PCR 产物)检测不同比例突变型 / 野生型样本，结果显示随突变型比例降低，荧光信号达峰时间逐渐延长，该体系可检出低至 1% 的突变型样本，但信号峰值需 90 分钟才能达到，整体检测耗时较长。

图 3 PCR 产物体积对 CBFR 检测灵敏度的影响

研究对比 2μL、5μL、10μL 三种 PCR 产物加入量的检测效果，结果表明 5μL PCR 产物可显著提升检测灵敏度、缩短荧光信号达峰时间，10μL PCR 产物会抑制反应进程、延缓信号峰值出现，最终确定 5μL 为最优 PCR 产物加入体积。

图 4 荧光报告分子浓度对 CBFR 检测灵敏度的影响

测试 2μM、4μM、8μM 三种荧光报告分子浓度，结果显示荧光报告分子浓度与检测灵敏度、反应速度呈正相关，浓度越高灵敏度越好、信号达峰越快，综合检测成本与效果，选定 4μM 为最优荧光报告分子浓度。

图 5 优化后 CBFR 检测法的灵敏度分析

经 4μM 荧光报告分子、5μL PCR 产物体系优化后，CBFR 检测法可在 45 分钟内检出低至 1% 的 EGFR 19 号外显子 delE746_A750 突变，高浓度突变样本无反应抑制现象，野生型样本无任何非特异性荧光信号，检测灵敏度与速度均得到大幅提升。

图 6 CBFR 检测法在临床 FFPE 样本中的验证

将优化后的 CBFR 法应用于 9 例临床非小细胞肺癌 FFPE 样本检测，7 例携带 delE746_A750 缺失的样本均呈现绿色荧光，2 例携带 delL747_P753 缺失的样本无荧光信号，检测结果与临床 PCR 测序结果完全一致，证实该方法对目标突变亚型具有高度特异性。

研究结论

该研究首次成功构建基于 CRISPR-Cas12a 的 CBFR 荧光检测法，通过优化荧光报告分子浓度与 PCR 产物用量，实现非小细胞肺癌中 EGFR 19 号外显子 delE746_A750 缺失亚型的高灵敏(检出限 1%)、高特异、低成本、快速(<1 小时)可视化检测，该方法无需精密大型仪器，适配设备不足的基层实验室，为非小细胞肺癌靶向治疗的突变筛查提供了简易高效的新型诊断工具。