新型生物发光系统实现艰难梭菌芽孢体内精准示踪

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development and Evaluation of Exosporium-Anchored Bioluminescent and Fluorescent Reporters for Tracking Clostridioides difficile Spores Formed In Vivo

中文标题：艰难梭菌芽孢外孢囊锚定生物发光与荧光报告系统的构建及体内示踪评价

发表期刊：《ACS Synthetic Biology》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Interdisciplinary Graduate Program in Genetics & Genomics, Texas A&M University, College Station, Texas 77843, United States

2.Department of Biology, Texas A&M University, College Station, Texas 77843, United States

3.Millennium Nucleus in the Biology of the Intestinal Microbiota, ANID – Millennium Science Initiative Program, Santiago 8370035, Chile

作者信息：

第一作者：Osiris K. Lopez-Garcia

通讯作者：Daniel Paredes-Sabja

研究背景

艰难梭菌是引发医院获得性及抗生素相关性结肠炎的关键厌氧芽孢致病菌，其芽孢是感染传播与复发的核心载体，但目前缺乏可在胃肠道感染过程中专一示踪体内新生芽孢的有效方法;传统培养、qPCR、共聚焦显微镜等检测手段无法区分接种芽孢与感染期新生芽孢，生物发光与荧光报告系统虽已广泛用于多种病原菌体内示踪，却尚未成功适配艰难梭菌芽孢的特异性表面标记，因此亟需构建可锚定在芽孢外孢囊的高效报告系统，填补体内芽孢示踪的技术空白。

研究方法

以艰难梭菌 R20291 高产孢菌株为材料，构建 ΔpyrE 基因缺陷型工程菌株，通过限制性酶切连接与 Gibson 组装技术，构建分别融合 48aa 截短型、193aa 修复型 BclA1 N 端结构域与 NanoLuc、mScarlet-i3、mNeonGreen 的重组质粒，经接合转化获得芽孢报告菌株;采用 BHIS 培养基厌氧培养菌株，通过相差显微镜评估产孢效率，纯化芽孢后开展生物发光检测、底物浓度梯度滴定及粪便基质干扰实验;借助透射电镜、Western blot 验证报告蛋白定位与芽孢超微结构完整性;构建小鼠 CDI 感染模型，监测小鼠体重、腹泻症状，定量粪便与盲肠内艰难梭菌活菌及芽孢载量，检测粪便生物发光信号，结合荧光显微镜与共聚焦成像分析荧光报告系统的芽孢标记效果，最终通过统计学方法完成数据解析。

实验结果

图 1 艰难梭菌芽孢表面标记系统设计

该图明确了艰难梭菌产孢发育阶段与 σ 因子调控规律，锁定 σK 调控的外孢囊相关基因为标记靶点，解析了 R20291 菌株 BclA1 假基因化的结构特征，筛选出高活性产孢特异性启动子 PcdeC，最终确立以 BclA1 N 端结构域为锚定、PcdeC 为驱动的芽孢表面报告系统设计方案，为后续载体构建提供核心依据。

图 2 纯化芽孢中生物发光表达的动态范围

该图对比了 48aa 与 193aa 两种 BclA1 N 端结构域介导的 NanoLuc 标记效果，结果显示两种菌株的生物发光信号均与芽孢数量呈正相关，且 193aa 修复型锚定结构的标记效率显著更高，芽孢浓度≥10⁵时信号较 48aa 截短型提升约 10 倍，证实修复型 BclA1 N 端可大幅优化芽孢生物发光检测的灵敏度与动态范围。

图 3 含 NanoLuc 的艰难梭菌芽孢透射电镜与免疫印迹分析

透射电镜结果表明 193aa-ntdBclA1-nLuc 芽孢与野生型芽孢超微结构无明显差异，报告蛋白未破坏芽孢外孢囊与衣壳组装;免疫印迹在芽孢外孢囊提取物中检测到 NanoLuc 特异性条带，皮层蛋白 SleC 条带无差异，直接证明 NanoLuc 融合蛋白成功定位于芽孢外孢囊，且不影响芽孢结构完整性。

图 4 Nano-Glo 底物优化及粪便基质中芽孢生物发光动态范围分析

底物滴定实验显示 NanoLuc 发光信号随底物浓度升高呈剂量依赖性增强，粪便基质会显著淬灭发光信号，PBS 中检测限约 10 个芽孢，粪便中需≥10⁴个芽孢才可检出，稀释粪便样本仅小幅提升信号却会降低检测灵敏度，明确了粪便基质对生物发光检测的抑制效应与实际检测阈值。

图 5 193aa-ntdBclA1-nLuc 感染小鼠的定植与疾病动态

小鼠 CDI 模型实验证实，NanoLuc 标记菌株与野生型菌株的定植能力、体重下降、腹泻发生率及严重程度均无显著差异，粪便与盲肠内活菌数、芽孢数基本一致，仅 NanoLuc 组可检测到粪便生物发光信号，证明该报告系统不影响艰难梭菌毒力与定植，可实现体内芽孢脱落的定性检测。

图 6 CDI 小鼠粪便定植、芽孢脱落与生物发光的时空定量关系

Kaplan-Meier 分析显示 NanoLuc 组小鼠粪便生物发光阳性时间与芽孢脱落(≥10⁴ CFU/g)时间高度重合，但发光信号与芽孢载量的线性相关系数 R² 仅 0.058，无定量相关性，证实该生物发光系统可定性指示芽孢脱落发生，却无法精准定量粪便中的芽孢数量。

图 7 荧光报告系统标记艰难梭菌芽孢的体外与体内分析

mScarlet-i3 仅在产孢后期部分细胞表达，成熟芽孢荧光信号大量丢失，体外仅少量芽孢保留荧光;mNeonGreen 信号被艰难梭菌自身自发荧光掩盖无法有效区分;体内仅结肠约 13.4% 芽孢可检测到 mScarlet-i3 荧光，mNeonGreen 仅盲肠约 13.9% 芽孢有荧光，表明荧光报告系统在成熟芽孢中标记效率低、稳定性差。

研究结论

本研究成功构建了基于艰难梭菌 BclA1 N 端结构域的外孢囊锚定报告系统，其中 193aa 修复型 BclA1 N 端融合 NanoLuc 的系统在不破坏芽孢结构、不影响菌株毒力与定植能力的前提下，可实现体内艰难梭菌新生芽孢的定性示踪，粪便检测限为 10⁴ CFU/g，虽无法精准定量芽孢数量，但能有效指示芽孢脱落进程，而 mScarlet-i3、mNeonGreen 荧光报告系统因信号丢失、自发荧光干扰等问题难以稳定标记成熟芽孢，该研究为艰难梭菌体内芽孢示踪提供了新型工具，也为荧光报告系统的后续优化指明了方向。