人诱导多能干细胞衍生平面含毛囊皮肤类器官的气液界面培养体系构建

皮肤作为人体最大的屏障器官，由表皮、真皮及皮下组织构成，且依赖毛囊、皮脂腺等附属结构实现完整功能。传统皮肤研究模型(如动物模型、重组人表皮)存在物种差异大、缺乏毛囊等附属结构的局限;而近年开发的人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生囊性皮肤类器官(SOs)虽含毛囊和皮脂腺，但呈 “倒置结构”—— 表皮朝向类器官中心、真皮暴露于环境，无法模拟生理状态下的气液接触(表皮 apical 面接触空气)，限制了表皮屏障功能、机械刺激响应等研究。

荷兰莱顿大学医学中心团队在《Journal of Visualized Experiments》上发表题为Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cellderived Planar Hair-bearing Skin Organoids Using an AirLiquid Interface Culture System的protocol：通过 “囊性类器官生成→机械扁平化→气液界面(ALI)培养” 流程，构建出生理取向的平面含毛囊皮肤类器官，第 27 天可形成复层色素化表皮及毛囊、皮脂腺样结构，为皮肤发育、疾病建模(病原体感染、UV 损伤)及药物筛选提供生理相关模型。

实验方法

囊性皮肤类器官(SOs)生成：以 3 株 hiPSC 系(LUMCi001-A、LUMCi004-A、WT2)为起始，Day -2 时将 70-80% 汇合的 hiPSC 用细胞解离试剂(CDR)处理 6 分钟，制成 3.5×10³ 细胞 /mL 的悬液，接种于 96 孔 U 底超低吸附板(100μL / 孔)，110×g 离心 6 分钟后 37℃ 5% CO₂培养;Day -1 换含抗生素的 hiPSC 维持培养基(hiMM)稀释 ROCK 抑制剂;Day 0 用含 2% 基底膜基质、2.5ng/mL BMP4、10μM SB431542、4ng/mL bFGF 的 hiPSC 基础培养基(hiMinM+SFB)诱导表面外胚层;Day 3-90 通过添加 LDN193189(非上皮细胞诱导)、类器官成熟培养基(OMM，含 Advanced 培养基、神经基础培养基等)，并在 Day 12 转移至 24 孔超低吸附板，期间按特定频率更换培养基(Day 15 起加 1% 基底膜基质，Day 45 后调整换液频率)，最终获得直径≥5mm、含毛囊原基 / 毛钉的囊性 SOs。

囊性 SOs 向平面 SOs 转化：Day 70-90 筛选含毛囊原基、副产物(软骨样组织)少的囊性 SOs;提前制备胶原包被插入物(12 孔规格)：将 I 型胶原稀释至 2mg/mL(用 1×PBS、5mM NaOH 调节)，150μL / 孔铺板后 37℃聚合 30 分钟;在层流 hood 立体显微镜下，用无菌手术刀切除囊性 SOs 的副产物，修剪两端后用镊子展开上皮层，切成 2-4 块，表皮朝上放置于胶原包被插入物，转移至含 600μL OMM 的 12 孔板，37℃ 5% CO₂培养。

气液界面(ALI)培养维护：平面化后 1-21 天，每周一、三、五更换 600μL OMM，维持 37℃ 5% CO₂、95% 相对湿度;21-27 天转移至无湿度培养箱(增强表皮屏障)，每日更换 800μL OMM;通过 H&E 染色、免疫荧光(β4 整合素、角蛋白 10/KRT10、兜甲蛋白 / LOR、IV 型胶原、PMEL 黑色素细胞标志物)及 Nile 红(皮脂腺染色)表征类器官结构。

关键结果

图1：平面 SOs 构建 workflow 与表征

该图展示完整实验流程与核心结果：(A)囊性 SOs 培养至 Day 80 左右(含毛囊原基);(B)囊性 SOs 扁平化后表皮朝上放置于胶原插入物，经 21 天湿润 ALI+6 天干燥 ALI 培养;(C)高倍镜下可见毛囊生长、皮脂腺样结构(箭头)及渐进性色素沉着;(D)免疫荧光显示：IV 型胶原标记基底膜，Nile 红标记皮脂腺，PMEL 标记黑色素细胞，证实平面 SOs 的生理结构完整性。

图2：囊性 SOs 关键发育阶段的形态检查点

该图明确囊性 SOs 的质量控制标准：(A)Day -2 需形成均匀细胞聚集体(左)，离心后细胞分布紊乱(右)为异常;Day 0 需呈致密细胞簇(左)，细胞死亡导致结构松散(右)为异常;Day 3 需出现明显外层上皮层(左)，无上皮层提示 BMP4 浓度需调整(右);Day 12 需见间充质细胞在一极聚集并包裹上皮囊(左)，上皮 / 间充质过度分化(中 / 右)为异常;Day 50 需呈双极形态(皮肤组织 + 少量副产物，左)，过度分化(中 / 右)影响后续平面化。(B)Day 80 含清晰毛钉的囊性 SOs(左三)可用于平面化，副产物过多(右)需排除。

图3：囊性 SOs 扁平化操作步骤

该图详解技术关键：(A)手术刀切除囊性 SOs 的副产物极;(B)修剪类器官两端便于展开;(C)切成小块后表皮朝上转移至胶原插入物;(D-F)示意图展示横截面操作逻辑，确保上皮层正确取向;(H)平面 SOs 在胶原插入物上的最终培养状态，插入物下方为 OMM 培养基，上皮层暴露于空气(ALI 状态)。

图4：平面 SOs 的成熟表征

该图验证平面 SOs 的结构成熟度：(A)H&E 染色显示，Day 1 平面 SOs 结构较简单，Day 27 形成复层表皮、真皮及含皮脂腺样结构的毛囊(箭头);(B)免疫荧光显示，Day 1 KRT10⁺细胞(早期表皮分化)分布于上皮层，Day 27 LOR⁺细胞(晚期角质化)形成表层，证实表皮分层分化完整。

全文总结

本研究的核心贡献是建立 “囊性类器官 - 平面化 - ALI 培养” 的完整体系 ：1)解决传统囊性 SOs 的倒置结构问题，使表皮 apical 面接触空气，模拟在体皮肤的气液环境，促进表皮复层化与屏障功能成熟;2)保留 hiPSC 衍生类器官的优势 —— 含毛囊、皮脂腺等附属结构，且可通过基因编辑实现规模化、个性化模型构建;3)该体系已成功应用于病原体感染(如猴痘病毒)、UV 辐射损伤建模及药物响应测试，为皮肤发育机制研究、皮肤病精准治疗提供生理相关的体外工具。