人类 Meynert 基底核类器官的生成及功能性 nbM - 皮质胆碱能投射通路构建

Meynert 基底核(nbM)是基底前脑主要的胆碱能输出核团，通过 nbM - 皮质胆碱能通路调控皮质功能、学习记忆，其功能异常与阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征(DS)等神经疾病密切相关。传统 2D 培养的胆碱能神经元无法模拟核团特异性结构与长距离投射，而现有脑类器官缺乏 nbM 特异性模型，难以复现胆碱能通路的完整功能。

为此，南京医科大学刘妍、郭兴及程青团队 在《Cell Stem Cell》上发表题为Generation of human nucleus basalis organoids with functional nbM-cortical cholinergic projections in transplanted assembloids的研究，创新构建人类 nbM 类器官(hnbMOs)，通过类器官融合形成 nbM - 皮质联合体，并建立双移植策略在体内重建功能性胆碱能投射通路。同时利用 DS 患者诱导多能干细胞(iPSCs)构建模型，成功模拟通路投射缺陷，为 nbM 相关神经疾病的机制研究与治疗开发提供全新工具。

实验方法

1. 核心实验材料

细胞来源：人类多能干细胞(hPSCs，包括 H9 胚胎干细胞、IMR90-4 诱导多能干细胞)、DS 患者来源 iPSCs(2DS3、DSP、DS1)。

关键试剂： sonic hedgehog(SHH)、嘌呤霉素(Purmorphamine)、β- 神经生长因子(β-NGF)等诱导因子;Matrigel 基质;胆碱能标志物抗体(CHAT、VACHT);病毒载体(AAV-hSYN-GFP、RV-ΔG-Cre-mCherry 等)。

动物模型：SCID Beige 免疫缺陷小鼠，用于类器官移植;DS 模型小鼠(Dp16)。

仪器设备：共聚焦显微镜、膜片钳、高密度微电极阵列(HD-MEA)、MRI 扫描仪、单细胞测序平台。

2. 关键实验技术

hnbMOs 诱导分化：hPSCs 经胚胎小体形成、神经上皮诱导后，通过高浓度 SHH 联合 Purmorphamine 诱导内侧神经节隆起(MGE)祖细胞，再经 β-NGF 促进胆碱能神经元成熟，全程 63 天获得 hnbMOs。

nbM - 皮质联合体构建：将 50 天龄 hnbMOs 与人类皮质类器官(hCOs)在 U 型 96 孔板中融合，培养 20 天形成功能性联合体。

体内通路重建：采用双移植策略，将 hnbMOs 移植至小鼠 nbM 区域、hCOs 移植至皮质区域，6 个月后验证投射通路。

功能检测：膜片钳记录电生理活性、钙成像检测网络同步性、病毒逆行示踪验证突触连接、单细胞测序分析转录组特征。

DS 模型构建：利用 DS-iPSCs 诱导 hnbMOs，对比正常与 DS 类器官的投射能力及功能差异。

关键结果

图1：hPSCs 诱导生成 hnbMOs 的流程与鉴定

该图展示 hnbMOs 的分化方案与特性：(A)分化流程(hPSCs→胚胎小体→神经上皮→hnbMOs)及关键因子(SHH、Purmorphamine、β-NGF);(B)免疫染色显示 hnbMOs 表达 nbM 标志物 CHAT、NKX2.1、FOXG1;(C)单细胞测序 UMAP 图显示 hnbMOs 包含放射状胶质细胞、中间祖细胞、GABA 能神经元及胆碱能神经元(CHNs);(D-H)转录组分析证实 hnbMOs 与人类胎儿 nbM 区域高度同源，且特异性表达 nbM 标志物(无 MS/DBB 核团标志物)。结果表明，该方案可高效生成具有 nbM 特异性身份的类器官，CHNs 占比达 38.13%。

图2：hnbMOs 中胆碱能神经元的形态与功能成熟

该图验证 CHNs 的功能性：(A)构建 CHAT-tdTomato 报告细胞系;(B-C)90% mCherry⁺细胞共表达 CHAT，证实报告系统特异性;(D)免疫染色显示 CHNs 具有长突起和树突棘结构;(E-F)膜片钳记录到钠电流、钾电流及动作电位;(G-H)ACh3.0 传感器检测到 KCl 刺激后乙酰胆碱释放;(I-K)钙成像与 MEA 记录显示 hnbMOs 存在同步神经网络活动。结果证实 hnbMOs 中的 CHNs 具备形态成熟度与生理功能完整性。

图3：hnbMOs 移植后在小鼠脑内的胆碱能投射

该图展示移植后 hnbMOs 的体内投射：(A)移植实验设计(hnbMOs 移植至小鼠 nbM 区域);(B-C)MRI 显示移植类器官定位准确;(D-E)免疫染色显示移植后 6 个月，hnbMOs 衍生纤维向皮质(S1、M1 区)形成长距离投射，且 CHNs 形态从巢状分布逐渐分散为投射神经元;(F-G)定量显示皮质区域人类纤维覆盖率最高，纹状体 / 海马较低;(H-I)突触标志物 hSYN 与 VACHT 共定位，证实突触形成;(J-K)CHNs 不表达 GBX2，排除中间神经元身份。结果表明，移植 hnbMOs 可在体内形成符合生理特征的 nbM - 皮质胆碱能投射。

图4：nbM - 皮质类器官联合体的体外构建与功能验证

该图呈现体外联合体的投射与功能：(A-B)联合体构建示意图(hnbMOs 与 hCOs 融合);(C-E)GFP 标记显示 hnbMOs 衍生纤维向 hCOs 定向投射，覆盖率随时间升高(6.06%→22.51%);(F-G)狂犬病病毒逆行示踪证实 CHNs 与 hCOs 形成单突触连接;(H-I)光遗传学刺激 hnbMOs 可在 hCOs 记录到 EPSCs;(J-K)胆碱能受体拮抗剂可抑制 hCOs 钙活动;(L-O)HD-MEA 检测到联合体的功能连接，且 KCl 刺激后 ACh 释放增加。结果证实，联合体可在体外复现 nbM - 皮质胆碱能通路的投射与功能同步性。

图5：双移植策略在体内重建人类 nbM - 皮质通路

该图展示移植联合体的体内功能：(A)双移植实验设计(hnbMOs→小鼠 nbM 区，hCOs→皮质区);(B-D)免疫染色显示 hnbMOs 衍生 GFP⁺纤维侵入 hCOs 移植物;(E-F)hCOs 移植物向宿主脑内多个区域投射，hnbMOs 投射偏好与生理一致;(G-H)膜片钳记录显示，光刺激 hnbMOs 移植物可在 hCOs 移植物中诱发 oEPSCs。结果表明，双移植策略成功在体内构建完整的人类源性 nbM - 皮质胆碱能投射通路。

图6：DS 来源 nbM - 皮质联合体的投射缺陷模型

该图模拟 DS 的通路异常：(A-B)DS 胎儿皮质 CHAT 表达显著降低;(C-D)DS - 联合体中 hnbMOs 向 hCOs 的投射覆盖率(约 12%)显著低于正常组(约 22%);(E-H)单细胞测序显示 DS-hnbMOs 中 CHNs 比例降低，轴突发育相关基因(ANK3、NCAM2)异常表达;(I-J)逆行示踪显示 DS - 联合体中突触连接细胞比例减少;(K-N)hCOs 的胆碱能受体表达降低，钙同步活动减少;(O-U)共培养与移植实验证实缺陷源于 DS-hnbMOs 自身异常，而非 hCOs。结果表明，该模型可有效复现 DS 中 nbM - 皮质胆碱能投射缺陷。

全文总结

本研究的核心贡献在于建立了 nbM - 皮质胆碱能通路的多维度模型体系：1)技术创新：通过优化诱导方案生成首个具有 nbM 特异性的 hnbMOs，CHNs 纯度高且功能完整;2)通路构建：首次通过类器官融合(体外)与双移植(体内)，分别复现胆碱能长距离投射与功能性突触连接，解决传统模型无法模拟通路完整性的痛点;3)疾病应用：利用 DS-iPSCs 构建模型，揭示轴突发育相关基因异常是投射缺陷的关键，为 DS、AD 等疾病的机制研究提供人类特异性工具;4)转化价值：该模型可用于胆碱能通路相关药物筛选(如促进投射修复的化合物)，也为细胞治疗(如 hnbMOs 移植修复受损通路)奠定基础。