钙内流驱动免疫激活：小分子赋能树突状细胞 EV 高效递送

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Identification of a Novel Small Molecule That Enhances the Release of Extracellular Vesicles with Immunostimulatory Potency via Induction of Calcium Influx

中文标题：新型小分子通过诱导钙内流增强具有免疫刺激活性的胞外囊泡释放

发表期刊：《ACS Chemical Biology》

影响因子：3.8

作者单位：

1.Moores Cancer Center, University of California San Diego, La Jolla, California 92093-0803, United States

2.Department of Rheumatology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University (TMDU), Tokyo 113-8519, Japan

3.The Herbert Wertheim School of Public Health and Longevity, University of California San Diego, La Jolla, California 92093-0901, United States

作者信息：

第一作者：Yukiya Sako

通讯作者：Dennis A. Carson;Tomoko Hayashi

研究背景

胞外囊泡(EV)可作为抗原与免疫调节分子的传递载体，在疫苗研发中极具潜力;树突状细胞来源的 EV 携带 MHC 分子与共刺激分子，能直接激活 T 细胞。细胞内 Ca²⁺升高可促进 EV 释放与免疫细胞活化，但传统钙诱导剂(如离子霉素)毒性较强，限制体内应用。因此，研究者从 2.8 万化合物库中经三重高通量筛选得到 80 个候选化合物，进一步从中筛选可安全诱导钙内流、增强树突状细胞释放免疫刺激型 EV 的小分子，为 EV 疫苗开发提供安全高效的小分子工具。

研究方法

以小鼠骨髓源树突状细胞(mBMDC)、THP-1 报告细胞为主要模型，采用 Fura-2/Fura-8 荧光探针检测胞内钙水平，通过钙回补实验与 SOCE 抑制剂验证钙内流机制;采用差速超速离心分离 EV，结合 MRPS、透射电镜、免疫印迹、高分辨流式进行 EV 表征;通过流式细胞术检测细胞与 EV 表面共刺激分子表达;利用 DO11.10 转基因小鼠 CD4⁺ T 细胞、CFSE 标记与 OVA 抗原肽体系评估 EV 介导的 T 细胞增殖;合成并筛选 634 的系列衍生物，开展构效关系分析，关联钙内流能力、EV 释放量与免疫刺激活性。

实验结果

图 1 化合物 634 提升 mBMDC 胞内钙离子水平

该图证实化合物 634 可显著诱导 mBMDC 发生钙内流，效果与阳性对照离子霉素(ION)相当，且在无胞外钙条件下可触发内质网钙释放，补充胞外钙后信号急剧上升，符合钙库操纵性钙内流(SOCE)特征;SOCE 抑制剂 BTP2 可显著阻断 634 介导的钙内流，明确 634 通过 Orai1 介导的 SOCE 通路提升胞内钙浓度。

图 2 化合物 634 促进 mBMDC 释放胞外囊泡

结果显示 10 μM 634 处理使 mBMDC 的 EV 释放量较对照组显著提升约 45%，EV 粒径主要分布于 200 nm 以下，符合小型 EV 标准;EV 富集 CD81、Alix 等标志性蛋白，几乎不含钙网蛋白等污染蛋白，电镜形态正常，蛋白 / 颗粒比与对照组无显著差异，证明 634 可特异性增加 EV 数量且不影响 EV 纯度与基本特性。

图 3 化合物 634 上调 mBMDC 与 EV 表面共刺激分子表达

634 可显著提高 mBMDC 表面 CD80、CD86、MHC II、CD40 的表达水平，该效应可被 SOCE 抑制剂 BTP2 阻断，表明依赖钙内流;同时 EV 表面 CD86、CD80 等共刺激分子表达同步升高，提示 634 不仅促进 EV 释放，还能提升单个 EV 的免疫刺激能力。

图 4 634 诱导的 EV 显著增强抗原特异性 T 细胞增殖

在 OVA 抗原肽存在时，来源于 634 处理组的 EV 可高效诱导 DO11.10 小鼠 CD4⁺ T 细胞增殖与 IL-2 分泌，效果接近 MPLA 阳性对照组;封闭 EV 表面 CD86/CD80 可完全消除该促增殖作用，证明 EV 的免疫激活依赖共刺激分子;等颗粒数对比实验进一步证实，634 不仅增加 EV 数量，还提升了 EV 的固有免疫刺激活性。

图 5 化合物 634 的构效关系衍生物设计

研究者以 634 为母核，对酯基、磺酰胺基进行修饰，合成 12 种衍生物，包括甲酯、丙酯、异丙酯、环己酯、酰胺、羧酸、N - 甲基磺酰胺等不同取代结构，用于系统解析药效必需基团。

图 6 钙内流能力与 EV 免疫活性呈显著正相关

仅保留酯基与磺酰胺基的衍生物可诱导钙内流，而酰胺化、去酯化、N - 甲基化衍生物完全丧失钙内流活性;钙内流水平与 EV 释放量、CD86 表达水平呈高度正相关;仅钙内流阳性衍生物诱导的 EV 可显著促进 T 细胞增殖，直接证明钙内流是 634 发挥促 EV 与免疫增强作用的核心机制。

研究结论

本研究从高通量筛选中鉴定出小分子化合物 634，其通过 Orai1 介导的 SOCE 通路诱导树突状细胞钙内流，既能显著提升 EV 释放数量，又能上调细胞与 EV 表面共刺激分子表达，使 EV 具备更强的抗原特异性 T 细胞激活能力;构效关系证实酯基与磺酰胺基是维持钙内流活性的必需基团，且钙内流能力直接决定 EV 的免疫刺激效果，为 EV 疫苗研发提供了机制清晰、安全性更优的新型小分子佐剂工具。