CD8⁺T 细胞来源的穿孔素通过抑制 β- 羟基丁酸加重肠道菌群失调与炎症性肠病

研究背景

炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，是一种慢性复发性胃肠道炎症性疾病，其发病机制与免疫功能紊乱和肠道菌群失调密切相关，但具体机制尚未完全明确。CD8⁺T 细胞作为重要的免疫细胞，在 IBD 发病中逐渐受到关注，其激活后可通过分泌穿孔素等效应分子损伤靶细胞。肠道代谢产物与肠道菌群、肠道炎症之间存在复杂的相互调控关系，β- 羟基丁酸作为一种重要的酮体代谢产物，已被证实具有抗炎和修复肠道黏膜的作用。然而，CD8⁺T 细胞来源的穿孔素是否通过调控代谢产物影响肠道菌群及 IBD 进展，目前尚不清楚。

来自首都医科大学附属北京友谊医院免疫研究中心、普通外科、消化内科，首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心的团队，在《Journal of Inflammation Research》期刊上发表的题为CD8⁺ T Cell-Derived Perforin Exacerbates Dysbiosis and Inflammatory Bowel Disease via β-Hydroxybutyrate Suppression in Mouse Colonic Epithelium的文章，揭示了 CD8⁺T 细胞产生的穿孔素(Perforin)通过抑制结肠上皮细胞中 β- 羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHB)的生成，破坏肠道菌群平衡，进而加重炎症性肠病(IBD)的发病机制，为 IBD 的治疗提供了新的靶点。

实验方法

1.样本收集与临床信息：招募 2023 年 2 月至 12 月首都医科大学附属北京友谊医院的 IBD 患者和健康志愿者，收集外周血样本，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，同时收集患者临床信息，所有实验均获得伦理委员会批准。

2.动物模型构建：

DSS 诱导结肠炎模型：6-8 周龄野生型(WT)和穿孔素缺陷型(Prf1⁻/⁻)小鼠饮用 2.5% 葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液 7 天，构建急性结肠炎模型，评估疾病活动指数(DAI)、体重变化、结肠长度及组织损伤。

CD8⁺T 细胞过继转移模型：从 WT 或 Prf1⁻/⁻小鼠脾脏中分离 naive CD8⁺T 细胞，静脉注射到 Rag2⁻/⁻γc⁻/⁻小鼠体内，6 周后评估结肠炎严重程度。

3.检测与分析方法：

流式细胞术：检测人 PBMCs 和小鼠结肠组织中 CD8⁺T 细胞、穿孔素⁺CD8⁺T 细胞及颗粒酶 B⁺CD8⁺T 细胞的比例。

组织学分析：通过 HE 染色评估结肠组织炎症损伤，AB/PAS 染色检测杯状细胞数量，UEA-I 染色观察黏液层厚度，FITC - 葡聚糖检测肠道屏障通透性。

分子生物学检测：采用 RNA 测序、实时荧光定量 PCR(qPCR)检测结肠组织中脂肪酸代谢相关基因(Hmgcs2、Pdk4 等)的表达;通过 ELISA 检测血浆中 β- 羟基丁酸水平。

肠道菌群与代谢组学分析：采用 16S rRNA 基因测序分析小鼠粪便菌群组成;通过超高效液相色谱 - 串联质谱(UPLC-MS/MS)进行粪便代谢组学分析。

4.HMGCS2 抑制剂实验：向 Prf1⁻/⁻小鼠腹腔注射 HMGCS2 抑制剂 hymeglusin，随后构建 DSS 诱导结肠炎模型，评估炎症程度和肠道菌群变化，验证 β- 羟基丁酸的介导作用。

5.统计学分析：使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析，采用 Student’s t 检验、单因素或双因素方差分析比较组间差异，P<0.05 为差异具有统计学意义。

关键结果

图 1：IBD 患者和小鼠中 CD8⁺T 细胞激活和穿孔素表达升高

该图通过公共数据库分析和实验验证，揭示了 IBD 中 CD8⁺T 细胞的激活状态。公共数据库 GSEA 分析显示，IBD 患者结肠组织中与 CD8⁺T 细胞激活、细胞杀伤相关的基因集显著富集。UC 和 CD 患者结肠组织中穿孔素(PRF1)和颗粒酶 B(GZMB)的转录水平显著高于健康对照。单细胞测序分析发现，UC 患者结肠中 PRF1⁺GZMB⁺CD8⁺T 细胞亚群比例显著增加，且 PRF1 和 GZMB 的表达水平上调。实验验证显示，IBD 患者 PBMCs 中穿孔素⁺CD8⁺T 细胞和 GZMB⁺CD8⁺T 细胞的比例显著高于健康对照;DSS 诱导结肠炎小鼠结肠组织中，CD8⁺T 细胞产生的穿孔素表达也明显升高，而肠系膜淋巴结和脾脏中无显著变化，提示肠道局部 CD8⁺T 细胞来源的穿孔素在 IBD 中具有关键作用。

图 2：穿孔素缺陷缓解 DSS 诱导的结肠炎

该图探讨了穿孔素缺陷对 DSS 诱导结肠炎的影响。与 WT 小鼠相比，Prf1⁻/⁻小鼠在 DSS 诱导后，体重下降更少，疾病活动指数(DAI)评分更低，结肠长度更长，结肠组织炎症损伤更轻。AB/PAS 染色显示，Prf1⁻/⁻结肠炎小鼠杯状细胞丢失减少;UEA-I 染色显示其远端结肠黏液层厚度增加。肠道屏障功能检测显示，Prf1⁻/⁻小鼠血清中 FITC - 葡聚糖的渗透率降低，提示肠道屏障完整性更好。这些结果表明，穿孔素缺陷可通过保护肠道黏膜屏障，减轻 DSS 诱导的肠道炎症。

图 3：CD8⁺T 细胞特异性穿孔素缺陷减轻结肠炎病理

该图通过过继转移模型验证了 CD8⁺T 细胞来源穿孔素的特异性作用。将 WT 或 Prf1⁻/⁻小鼠的 naive CD8⁺T 细胞静脉注射到 Rag2⁻/⁻γc⁻/⁻小鼠体内，6 周后发现，接受 Prf1⁻/⁻CD8⁺T 细胞的小鼠体重下降更少，结肠重量更轻、结肠壁厚度更薄，结肠组织炎症程度显著减轻。该结果证实，CD8⁺T 细胞产生的穿孔素是加重肠道炎症的关键因素，特异性抑制 CD8⁺T 细胞中的穿孔素可有效缓解结肠炎。

图 4：Prf1⁻/⁻小鼠中 Hmgcs2 表达上调增加 β- 羟基丁酸水平

该图揭示了穿孔素缺陷对结肠代谢的影响及相关机制。RNA 测序和 GSEA 分析显示，Prf1⁻/⁻结肠炎小鼠结肠组织中脂肪酸代谢通路显著富集。粪便代谢组学分析显示，酮体代谢和脂肪酸氧化相关基因富集。qPCR 验证显示，Prf1⁻/⁻小鼠结肠组织中 Hmgcs2(β- 羟基丁酸合成的关键限速酶)和 Pdk4(脂肪酸氧化敏感标志物)的 mRNA 表达水平显著升高。β- 羟基丁酸合成通路分析显示，Prf1⁻/⁻结肠炎小鼠粪便和血浆中 β- 羟基丁酸的浓度均显著高于 WT 结肠炎小鼠。外源性注射 β- 羟基丁酸可增加 WT 结肠炎小鼠的结肠长度，减轻肠道炎症，并调节肠道菌群中厚壁菌门 / 拟杆菌门(F/B)的比例，进一步证实 β- 羟基丁酸的抗炎作用。

图 5：Prf1 缺陷影响结肠炎小鼠肠道菌群组成

该图通过 16S rRNA 测序分析了穿孔素缺陷对肠道菌群的调控作用。OTU 数量、Chao1 指数、Shannon 指数和 Simpson 指数显示，Prf1⁻/⁻结肠炎小鼠肠道菌群多样性与 WT 小鼠无显著差异，但主成分分析(PCA)显示两组小鼠肠道菌群组成存在明显聚类差异。在门水平上，Prf1⁻/⁻结肠炎小鼠肠道中厚壁菌门 / 拟杆菌门(F/B)的比例显著升高。在属水平上，与肠道代谢和屏障功能相关的厌氧菌 Alloprevotella 和 Parabacteroides 的相对丰度显著增加，这些菌群被证实具有产生短链脂肪酸、减轻肠道炎症的作用，提示穿孔素缺陷可通过调节肠道菌群组成改善结肠炎。

图 6：抑制 HMGCS2 增加 Prf1⁻/⁻小鼠对 DSS 诱导结肠炎的易感性

该图验证了 HMGCS2/β- 羟基丁酸通路在穿孔素介导结肠炎中的关键作用。向 Prf1⁻/⁻小鼠注射 HMGCS2 抑制剂 hymeglusin 后，DSS 诱导的结肠炎症状加重，表现为体重下降更多、DAI 评分更高、结肠长度更短，结肠组织炎症损伤更严重。16S rRNA 测序显示，抑制 HMGCS2 后，Prf1⁻/⁻小鼠肠道菌群组成发生显著改变，菌群多样性降低，之前升高的 Alloprevotella 和 Parabacteroides 的丰度显著减少。该结果表明，HMGCS2 抑制剂通过降低 β- 羟基丁酸水平，破坏肠道菌群平衡，从而逆转了穿孔素缺陷带来的抗炎保护作用，进一步证实 β- 羟基丁酸是穿孔素调控 IBD 的关键介导分子。

全文总结

本研究通过临床样本分析、动物模型验证及多组学检测，揭示了 CD8⁺T 细胞来源的穿孔素在炎症性肠病中的作用及机制：IBD 患者和结肠炎小鼠中，CD8⁺T 细胞产生的穿孔素表达显著升高;穿孔素缺陷可通过上调结肠组织中 Hmgcs2 的表达，增加 β- 羟基丁酸的生成，进而调节肠道菌群组成(增加 Alloprevotella 和 Parabacteroides 等有益菌丰度)、保护肠道黏膜屏障，最终减轻肠道炎症;而抑制 HMGCS2 可逆转穿孔素缺陷的保护作用，加重结肠炎。该研究首次阐明了 “CD8⁺T 细胞 - 穿孔素 - HMGCS2/β- 羟基丁酸 - 肠道菌群” 这一调控轴在 IBD 发病中的关键作用，为 IBD 的治疗提供了新的靶点，如靶向穿孔素的产生或补充 β- 羟基丁酸等代谢产物可能成为 IBD 治疗的新策略。