乳酸通过上调肾脏 PD-L1 表达诱导脓毒症急性肾损伤免疫抑制的机制研究

研究背景

脓毒症是全球重症监护室死亡的主要原因，急性肾损伤(AKI)是其严重并发症，与患者死亡率和医疗成本密切相关。目前对 septic AKI 的发病机制尚未完全明确，已知包括微循环异常、代谢紊乱、肾小管上皮细胞损伤及炎症反应等。免疫检查点分子 PD-1/PD-L1 在免疫调节中起关键作用，可负向调控淋巴细胞活化并促进其凋亡，与脓毒症相关免疫抑制密切相关。脓毒症患者血清乳酸水平显著升高，且与死亡率正相关，但乳酸与 PD-1/PD-L1 通路在 septic AKI 中的相互作用尚未被阐明。因此，探究乳酸与 PD-1/PD-L1 通路在 septic AKI 免疫抑制中的作用及机制，对开发新的治疗策略具有重要意义。

来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院重症医学科、哈尔滨医科大学附属第一医院重症医学科的团队在《Journal of Microbiology, Immunology and Infection》上发表的题为Lactate up-regulates the expression of PD-L1 in kidney and causes immunosuppression in septic Acute Renal Injury的文章，明确乳酸可上调脓毒症急性肾损伤(septic AKI)小鼠肾脏中 PD-L1 的表达，通过激活 PD-1/PD-L1 通路诱导 T 细胞凋亡，导致免疫抑制，为 septic AKI 提供了新的治疗靶点。

实验方法

1.Septic AKI 动物模型构建：采用盲肠结扎穿孔术(CLP)构建 C57/B6 小鼠 septic AKI 模型，对照组行假手术。术后 24 小时收集血液和肾脏组织，通过检测血清肌酐(Cr)水平、肾脏通透性及血清 IL-10、乳酸水平，验证模型构建成功。

2.体外细胞实验：将小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)接种于 6 孔板，用 0.5mg/ml 脂多糖(LPS)分别刺激 0、1、3、6 小时，对照组不处理，收集细胞用于后续 PD-L1 表达检测。

3.蛋白表达与分子检测：采用 Western blot 技术检测肾脏组织和 TCMK-1 细胞中 PD-L1 蛋白表达;通过 ELISA 试剂盒检测血清乳酸、IL-10 水平，其中乳酸检测使用 SIGMA-ALDRICH 的 Lactate Assay kit。

4.免疫细胞功能分析：收集小鼠全血 100μl，经红细胞裂解后，用 CD3 FITC、PD-1 PE、CD4 PerCP、CD8 Violet 510 抗体标记淋巴细胞，通过流式细胞术检测淋巴细胞总数、CD3+T 细胞数量及 CD4+、CD8+T 细胞中 PD-1 的表达水平。

5.肾脏通透性检测：CLP 术后 24 小时，小鼠经尾静脉注射 4% 伊文思蓝(2.5ml/kg)，2 小时后经升主动脉灌注冰 PBS，收集肾脏组织匀浆，离心后取上清与等体积 100% 三氯乙酸混合，通过分光光度计检测 610nm 处吸光度，评估肾脏通透性。

关键结果

图.1 CLP 成功构建 C57/B6 小鼠 septic AKI 模型

该图验证了模型构建的有效性：与假手术组相比，CLP 组小鼠血清肌酐(Cr)水平显著升高(图 1A)，肾脏通透性增加 73%(图 1B)，血清 IL-10(图 1C)和乳酸水平(图 1D)均明显上升(均 p<0.05)。这些结果表明 CLP 诱导的 polymicrobial 脓毒症成功引发了 AKI，且模型中存在代谢紊乱和炎症反应，为后续探究免疫抑制机制奠定了基础。

图.2 LPS 上调肾小管上皮细胞 PD-L1 表达

该图揭示了 LPS 对 PD-L1 表达的影响：Western blot 结果显示，CLP 组小鼠肾脏 PD-L1 表达较假手术组升高 71%(图 2A);体外实验中，LPS 刺激 6 小时后，TCMK-1 细胞 PD-L1 表达水平接近对照组的 2 倍(图 2B)(均 p<0.05)。这表明脓毒症相关的 LPS 可直接诱导肾小管上皮细胞 PD-L1 表达上调，提示 PD-L1 可能参与 septic AKI 的病理过程。

图.3 Septic AKI 中淋巴细胞和 CD3+T 细胞数量减少

该图反映了 septic AKI 中的免疫细胞变化：流式细胞术分析显示，与假手术组相比，CLP 组小鼠外周血淋巴细胞数量减少 64%(图 3A)，CD3+T 细胞数量减少 27%(图 3B)(均 p<0.05)。这一结果证实 septic AKI 中存在淋巴细胞耗竭，可能是导致免疫抑制的重要原因。

图.4 Septic AKI 中 CD4 + 和 CD8+T 细胞 PD-1 表达增加

该图明确了 T 细胞上 PD-1 的表达变化：流式细胞术结果显示，CLP 组小鼠外周血 CD8+T 细胞(图 4A)和 CD4+T 细胞(图 4B)中 PD-1 的表达水平均显著高于假手术组(p<0.05)。结合图 2 中 PD-L1 的上调，提示 PD-1/PD-L1 通路的相互作用可能诱导 T 细胞凋亡，进而加剧免疫抑制。

图.5 乳酸上调脓毒症小鼠肾脏 PD-L1 表达

该图验证了乳酸对 PD-L1 的调控作用：通过腹腔注射 100μmol 乳酸处理小鼠，无论假手术组还是 CLP 组，肾脏 PD-L1 表达均显著升高(p<0.05)(图 5)。这一结果直接证实乳酸是调控 septic AKI 中肾脏 PD-L1 表达的关键因素，明确了乳酸与 PD-1/PD-L1 通路的关联。

全文总结

该研究通过 CLP 构建 septic AKI 小鼠模型，结合体外细胞实验，系统探究了乳酸与 PD-1/PD-L1 通路在免疫抑制中的作用机制。研究发现，CLP 成功诱导小鼠出现 AKI 相关病理改变，伴随血清乳酸升高、肾脏 PD-L1 表达上调及 T 细胞功能异常;LPS 可直接促进肾小管上皮细胞 PD-L1 表达，而乳酸能进一步上调肾脏 PD-L1 水平;PD-1/PD-L1 通路的激活导致淋巴细胞和 CD3+T 细胞数量减少、CD4 + 和 CD8+T 细胞 PD-1 表达增加，最终诱导 T 细胞凋亡，引发免疫抑制。该研究首次阐明了乳酸 - PD-L1-PD-1 轴在 septic AKI 免疫抑制中的核心作用，为临床通过阻断乳酸受体或 PD-1/PD-L1 通路治疗 septic AKI 提供了重要的实验依据。