不止疗效预测：PD-1/PD-L1 表达分层下，肺癌免疫调控及 TP53 突变关联被揭示

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，尽管手术、放疗、化疗及靶向治疗等方案不断发展，但患者预后仍不理想。PD-1/PD-L1 免疫治疗作为新一代抗癌疗法，通过阻断免疫检查点、恢复 T 细胞功能来攻击肿瘤，为肺癌治疗带来新突破，但仅部分患者能从中获益，且存在原发性或获得性耐药问题。

PD-1 与配体 PD-L1 结合后，会抑制 PIK3CA/Akt 等信号通路，下调抗肿瘤免疫，导致肿瘤免疫逃逸。目前，PD-1/PD-L1 表达常被用作免疫治疗疗效预测标志物，但肺癌患者中 PD-1/PD-L1 表达差异的分子机制、相关免疫基因特征及与基因突变的关联尚未完全明确。深入解析这些问题，可为优化肺癌免疫治疗策略、开发潜在生物标志物提供重要依据。

由浙江中医药大学附属杭州中医院的研究人员发表在《Journal of Applied Genetics》上题为Genomic Profiling Reveals Immune‑Related Gene Differences in Lung Cancer Patients Stratified by PD1/PDL1 Expression: Implications for Immunotherapy Efficacy的文章，基于 TCGA 数据库系统分析了 1017 例肺癌患者的 PD-1/PD-L1 表达特征，揭示了高、低表达组的免疫相关基因差异及与 TP53 突变的关联，为肺癌免疫治疗的精准实施提供了分子层面的参考。

实验方法

1.数据收集：从 TCGA 数据库下载 1017 例肺癌患者(含肺腺癌 LUAD 和肺鳞癌 LUSC)的临床数据、RNA 表达数据、体细胞突变数据及拷贝数变异数据，根据 PD-1(PDCD1)和 PD-L1(CD274)的 mRNA 表达水平，将患者分为高表达组(HE，n=509)和低表达组(LE，n=508)。

2.差异基因筛选与功能富集分析：采用 limma 包筛选两组间的差异表达基因(DEGs)，筛选标准为 | log2FC|≥1.0 且 P≤0.05;通过 clusterProfiler 工具进行 GO 功能富集分析(生物过程 BP、分子功能 MF、细胞组分 CC)和 KEGG 通路分析(P<0.05 为筛选标准);利用 GSEA 4.10 软件进行基因集富集分析，以 NES>1、P<0.05、FDR<0.25 筛选阳性基因集。

3.蛋白互作网络与共表达模块分析：将差异表达基因导入 STRING 数据库获取蛋白 - 蛋白相互作用(PPI)信息，利用 Cytoscape 3.7.2 软件构建 PPI 网络，通过 MCODE 插件筛选关键模块(cytohubba 评分及节点数 > 5、P≤0.05);借助 GeneMANIA 分析 PD-1/PD-L1 相关基因的共表达网络。

4.突变景观分析：从 GDC 数据库下载经 MUTECT2 处理的单核苷酸变异数据，利用 MAFtools 包分析两组患者的基因突变特征，重点关注高频突变基因及 TP53 突变与 PD-1/PD-L1 表达的相关性。

5.统计分析：采用 R 软件进行统计分析，通过 Cox 模型分析预后，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01 为差异极显著。

关键结果

图 1：PD-1/PD-L1 高、低表达组患者预后分析

该图展示了肺癌患者 PD-1/PD-L1 表达水平及预后差异。结果显示，高表达组(HE)与低表达组(LE)的 PD-1(图 1A)和 PD-L1(图 1B)mRNA 表达存在显著分层，但两组患者的总生存期(OS，p=0.88)、无病间隔期(DFI，p=0.66)、疾病特异性生存期(DSS，p=0.91)及无进展间隔期(PFI，p=0.35)均无统计学差异(图 1C-F)。临床特征分析表明，两组患者在年龄、肿瘤分期、疾病类型、生命状态方面无显著差异(P>0.05)，仅性别分布存在统计学差异(P<0.05)，男性在低表达组中占比更高(65.55% vs 高表达组 54.42%)。

图 2：差异表达基因筛选及 PD-1/PD-L1 相关蛋白互作与共表达网络

该图呈现了两组患者的差异基因特征及 PD-1/PD-L1 相关基因网络。通过 limma 包筛选出 391 个差异表达基因，其中上调基因 217 个，下调基因 174 个(图 2A)。蛋白互作网络分析显示，PDCD1LG2、CD3E、LCK、CD3D、CD3G 等基因与 PD-1/PD-L1 密切相关(图 2B);共表达网络分析进一步验证了这些基因的关联性，提示它们可能共同参与 PD-1/PD-L1 介导的免疫调控过程(图 2C)。

图 3：差异表达基因的功能富集分析

该图通过 GO 和 KEGG 分析揭示了差异表达基因的功能特征。GO 富集分析中，生物过程(BP)主要富集于 “适应性免疫应答”“淋巴细胞活化调控”“T 细胞活化” 等(图 3A);细胞组分(CC)集中在 “细胞膜外侧”“MHC 蛋白复合物”“免疫突触” 等(图 3C);分子功能(MF)以 “免疫受体活性”“MHC 蛋白复合物结合”“细胞因子受体活性” 为主(图 3B)。KEGG 通路分析显示，差异基因主要富集于 “造血细胞谱系”“细胞粘附分子”“移植物抗宿主病”“Th17 细胞分化” 等免疫相关通路(图 3D)，强调了 PD-1/PD-L1 在免疫应答调控中的核心作用。

图 4：GSEA 富集分析结果

该图展示了差异表达基因集的通路富集情况。GSEA 分析共筛选出 14 个显著富集的标志信号通路(NES>1、P<0.05、FDR<0.25)，主要包括 “同种异体移植排斥反应”“炎症反应”“干扰素 γ 应答”“KRAS 信号上调”“IL6-JAK-STAT3 信号上调”“补体通路” 等(图 4)。这些通路多与免疫激活、炎症调控及肿瘤进展相关，提示 PD-1/PD-L1 表达差异可能通过调控这些通路影响肺癌的免疫微环境。

图 5：PPI 网络构建及核心基因鉴定

该图构建了差异表达基因的 PPI 网络并筛选核心基因。基于 STRING 数据库和 Cytoscape 软件，构建了包含 60 个节点、1264 条边的关键模块(图 5A);进一步筛选出排名前 10 的核心基因，包括 CD4、CD86、CD8A、ITGB2、TYROBP、ICP2、PTPRC、ITGAM、FCGR3A、CTLA4(图 5B)，这些基因均为免疫相关基因，可能在 PD-1/PD-L1 介导的肺癌免疫调控中发挥关键作用。

图 6：核心差异基因的 mRNA 表达验证

该图验证了前 10 个核心基因在两组中的表达差异。结果显示，CD4、CD8A、CD86、CTLA4、FCGR3A、ITGAM、ITGB2、ICP2、PTPRC、TYROBP 的 mRNA 水平在高表达组(HE)中均显著高于低表达组(LE)(P<0.001)(图 6A-H)，证实这些免疫相关基因的表达与 PD-1/PD-L1 表达呈正相关，进一步支持它们在肺癌免疫调控中的协同作用。

图 7：突变景观及 TP53 突变特征

该图展示了两组患者的基因突变特征及 TP53 突变分布。突变景观分析显示，TP53、TTN、CSMD3、MUC16、RYR2 是两组患者中突变频率最高的 5 个基因，高表达组 TP53 突变率(69%)略高于低表达组(65%)(图 7A)。TP53 突变位点分析显示，两组肺癌患者的突变类型包括剪接位点突变、移码缺失、无义突变、错义突变、移码插入、框内缺失及框内插入(图 7B)，提示 TP53 突变可能与 PD-1/PD-L1 表达调控相关。

图 8：PD-1 与 TP53 的相关性分析

该图分析了肺癌患者中 PD-1 表达与 TP53 突变的关联。结果显示，PD-1 表达与 TP53 突变呈显著正相关(r=0.067，P=0.033)(图 8)，表明 TP53 突变可能参与调控 PD-1 的表达，进而影响肺癌的免疫微环境和免疫治疗应答。

全文总结

本研究基于 TCGA 数据库，对 1017 例肺癌患者进行 PD-1/PD-L1 表达分层分析，揭示了高、低表达组的分子特征与免疫相关机制。研究发现，PD-1/PD-L1 高表达组与低表达组在总生存期等预后指标上无显著差异，但性别分布存在差异;共筛选出 391 个差异表达基因，其中 CD4、PTPRC 等核心基因在高表达组显著上调，且这些差异基因富集于适应性免疫应答、炎症反应、IL6-JAK-STAT3 等免疫相关通路。此外，TP53 作为肺癌中高频突变基因，其突变与 PD-1 表达呈显著正相关，提示 TP53 突变可能通过调控 PD-1/PD-L1 表达影响肿瘤免疫逃逸。

这些发现不仅明确了 PD-1/PD-L1 表达差异相关的免疫基因特征及基因突变关联，还为肺癌免疫治疗提供了重要启示：CD4、PTPRC 等核心基因可作为潜在生物标志物，辅助筛选免疫治疗获益人群;TP53 突变状态可纳入免疫治疗疗效预测体系，指导精准治疗方案制定。但研究存在局限性，如依赖回顾性 TCGA 数据、未纳入临床免疫治疗疗效数据进行验证，未来需开展前瞻性临床研究进一步验证这些发现的临床价值。