优化原代小胶质细胞分离 protocol：高纯度细胞获取新方案来了

研究背景

小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在维持神经稳态、调节神经发育与炎症反应、参与组织修复等过程中发挥关键作用，更是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病发病机制研究的核心靶点。目前常用的原代小胶质细胞分离方法中，磁珠分选(MACS)和流式分选(FACS)虽纯度高，但成本高、回收率低;传统摇晃法操作简便但细胞纯度不足。而永生细胞系(如 BV2)存在基因表达异常、功能模拟性差等缺陷，无法准确还原生理状态下的小胶质细胞特性。因此，开发一种高效、经济、高保真的原代小胶质细胞分离方案，对神经科学机制研究具有重要意义。

来自南昌大学第一附属医院神经外科、江西神经疾病重点实验室的团队，在《Bio-protocol》上发表了这篇题为Revisiting Primary Microglia Isolation Protocol: An Improved Method for Microglia Extraction的文章，通过优化传统混合胶质细胞培养摇晃法，成功获得高纯度、高产量、高活力的原代小胶质细胞，同时缩短实验周期、减少动物使用量及整体成本。

实验方法

本研究优化了传统混合胶质细胞培养摇晃法，核心步骤分为 5 步，全程无需抗生素或抗真菌试剂：

1.实验材料准备：选用出生 1-2 天的 SNCA A53T 转基因小鼠或 C57BL/6J 小鼠，以及 DMEM/F12 培养基、B27 添加剂、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、胎牛血清(FBS)等试剂，搭配细胞培养瓶、离心管、70μm 细胞筛等耗材及 CO₂ 培养箱、摇床等设备。

2.原代胶质细胞分离与初期培养：颈椎脱臼处死小鼠后，75% 乙醇消毒 5 分钟，无菌条件下取完整脑组织，去除脑膜和血管后分离皮层与海马组织;用 0.25% 胰酶消化 3 分钟，FBS 中和后经 70μm 细胞筛过滤，300×g 离心 5 分钟，沉淀重悬于 20% FBS 培养基中，接种至 T25 培养瓶，37℃、5% CO₂ 培养 24 小时。

3.小胶质细胞增殖诱导与分层培养：24 小时后更换培养基并清洗去除漂浮碎片，加入含 20% FBS 的培养基继续培养 5 天;第 5 天细胞形成分层生长(底层为星形胶质细胞和成纤维细胞，上层为小胶质细胞)，添加 20 ng/mL M-CSF 促进小胶质细胞增殖，培养至第 8 天。

4.小胶质细胞分离纯化：第 9 天将培养瓶密封，置于 37℃ 摇床以 200 rpm 摇晃 2 小时，收集悬浮的小胶质细胞并重新接种;原培养瓶补充培养基继续培养 5 天后，可通过相同方法二次收获小胶质细胞。

5.细胞鉴定与功能验证：采用免疫荧光染色(小胶质细胞标志物 Iba1、星形胶质细胞标志物 GFAP)和流式细胞术(表面标志物 CD11b)验证细胞纯度;通过 LPS(1 μg/mL)刺激，检测 CD40 表面表达及 IL-6、IL-1β 等细胞因子水平，验证细胞功能活性。

关键结果

图 1：培养第 1-2 天：脑源性细胞形态及纯化前预处理效果

图 A 展示了第 1 天原代细胞分离的流程示意图，明确了从取脑到接种培养的核心步骤;图 B 对比了培养第 2 天换液前后的细胞形态：换液前可见大量漂浮的细胞聚集物和组织碎片，换液清洗后，贴壁细胞形态更清晰，有效去除杂质，为后续胶质细胞分层生长和小胶质细胞纯化奠定了基础，保障了初期培养环境的稳定性。

图 2：培养第 5-9 天：小胶质细胞增殖与纯化后形态特征

图 A 呈现了第 5-9 天的细胞培养流程，突出了 M-CSF 诱导增殖和摇床分离的关键步骤;图 B 显示，第 5 天细胞已形成明显分层，上层为圆形或椭圆形的小胶质细胞;第 8 天细胞碎片显著减少，小胶质细胞形态均一性提升;第 9 天经摇床分离纯化后，获得的小胶质细胞纯度显著提高，且通过二次培养可实现第二批细胞收获，证明该方案具有高效的细胞产量优势。

图 3：小胶质细胞纯度鉴定与功能验证

图 A 免疫荧光染色结果显示，分离的细胞中 Iba1 标志物阳性(小胶质细胞)比例高，GFAP 阳性(星形胶质细胞)比例极低，直观证明细胞纯度;图 B 流式细胞术通过 CD11b 特异性标记，进一步量化验证了小胶质细胞的高纯度;图 C 显示 LPS 刺激后，小胶质细胞 CD40 表面表达显著上调，表明细胞可正常激活;图 D qPCR 结果显示，LPS 刺激组促炎因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)表达升高，抗炎因子(TGF-β)表达变化符合炎症反应规律，证实分离的小胶质细胞具有正常的免疫功能活性，可用于后续机制研究。

全文总结

本研究针对传统原代小胶质细胞分离方法的不足，优化了混合胶质细胞培养摇晃法，通过在初期培养添加 B27 添加剂维持细胞存活与功能，后期补充 M-CSF 促进小胶质细胞增殖，仅需 9 天即可获得纯度约 90%、单只小鼠产量达 1.6×10⁶ 个的高活力原代小胶质细胞，且无需使用抗生素，降低了实验成本和动物使用量，同时通过免疫荧光、流式细胞术及功能验证证实了细胞的纯度和活性。该改良方案为神经退行性疾病(如帕金森病)、脑损伤等相关研究提供了优质、可控的体外模型，具有重要的实验应用价值。