高通量分离正常与肺纤维化人肺泡上皮细胞：疾病建模新工具登场

研究背景

2 型肺泡上皮(AT2)细胞是肺稳态维持和损伤修复的核心干细胞，不仅负责分泌肺表面活性物质，还能分化为 1 型肺泡上皮细胞参与肺泡再生，在肺疾病建模、药物筛选及细胞治疗中具有不可替代的价值。IPF 等慢性肺部疾病中，AT2 细胞功能异常是疾病进展的关键，但现有分离方法存在诸多局限：流式分选(FACS)纯度高但通量低、耗时久、成本高;传统磁珠分选需手动优化，稳定性不足;而 IPF 肺组织因纤维化重构、细胞丰度低，分离难度更大。临床细胞治疗对 AT2 细胞的规模化需求，进一步凸显了开发高通量、高保真分离方案的迫切性。

《Scientific Reports》上这篇High-throughput isolation of normal and pulmonary fibrosis human alveolar epithelial cells(高通量分离正常与肺纤维化人肺泡上皮细胞)的研究，建立了一套包含高效酶促肺组织消化和自动化细胞纯化的完整流程，通过靶向 HTII-280 表面蛋白的自动化磁珠分选(MACS)技术，从健康和特发性肺纤维化(IPF)肺组织中高通量获取高纯度、高活力的 2 型肺泡上皮(AT2)细胞，且分离后细胞仍保持功能完整性。

实验方法

1.实验材料准备：选用移植捐赠被拒的健康肺组织及 IPF 患者切除的病变肺组织，试剂包括 dispase II 酶、DNase I、HTII-280 抗体、CD45 磁珠、Matrigel 基质胶等，核心设备为 autoMACS® Pro 自动化磁珠分选仪、流式细胞仪及共聚焦显微镜。

2.肺组织酶促与机械消化：健康肺组织(0.2-18 克)用 2 U/mL dispase II 溶液经远端气道注射充气，剪碎为 1mm³ 小块后，加入 DNase I 在 37℃摇床消化 30 分钟;IPF 组织则增加用量(>25 克)、延长机械剪碎时间至 3 分钟，并增加一次红细胞裂解步骤。消化后经 100μm 和 40μm 细胞筛两级过滤，离心收集单细胞悬液。

3.自动化 MACS 分选纯化 AT2 细胞：采用两种分选策略：1 步策略直接通过 HTII-280 抗体标记阳性分选;2 步策略先通过 CD45 磁珠 depletion 去除白细胞，再进行 HTII-280 阳性分选(IPF 组织仅用 2 步策略)。分选全程通过 autoMACS® Pro 自动化完成，收集阳性组分即为纯化 AT2 细胞。

4.3D 肺泡球培养：将纯化的 AT2 细胞(5×10³ 个 / 孔)混悬于 Matrigel 中，接种至 24 孔板形成液滴，加入含 EGF、FGF-10 等因子的 3D 培养基，前 48 小时添加 ROCK 抑制剂 Y-27632，37℃、5% CO₂培养 1 个月，期间每 2-3 天换液一次。

5.细胞鉴定与功能验证：通过流式细胞术检测 EPCAM+/HTII-280 + 双阳性比例验证纯度;免疫荧光染色检测 Pro-SPC、AQP5 等标志物;qPCR 分析谱系标志物表达;单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)确认 AT2 细胞特征;3D 培养中评估肺泡球形成效率、增殖能力及形态表型。

关键结果

图 1：AT2 细胞分离与下游分析流程示意图

该图清晰展示了从肺组织处理到功能验证的完整 workflow：(A)通过酶促 + 机械消化获得单细胞悬液;(B)采用 1 步或 2 步自动化 MACS 分选靶向富集 HTII-280 阳性 AT2 细胞;(C)分选后细胞经 3D 培养形成肺泡球，后续通过免疫染色、qPCR 等技术进行表型和功能分析。整个流程实现了从组织到功能验证的标准化，为实验可重复性提供保障。

图 2：健康肺组织 AT2 细胞分离效率分析

(A)健康肺组织经消化后平均获得 23.9×10⁶个 / 克细胞;(B)1 步分选将 AT2 细胞纯度从 17% 提升至 85%，2 步分选从 23% 提升至 95%，且 2 步策略纯度更稳定;(C)两种策略分选后细胞活力均保持在 92% 左右，仅轻微下降 2-3%;(D)1 步分选产量(2.5×10⁶个 / 克)略高于 2 步(2.0×10⁶个 / 克)，但无统计学差异;(E)流式示例显示，2 步分选后 EPCAM+/HTII-280 + 细胞比例从 15.8% 提升至 99%，CD45 阳性白细胞被有效去除。

图 3：IPF 肺组织 AT2 细胞分离效率分析

(A)IPF 组织消化后平均获得 8.8×10⁶个 / 克细胞，低于健康组织;(B)2 步分选将 AT2 细胞纯度从 9% 显著提升至 90%，增幅达 81%;(C)分选前细胞活力为 96%，分选后降至 87%，仍保持较高水平;(D)IPF 组织 AT2 细胞产量为 2.2×10⁵个 / 克，虽低于健康组织，但符合 IPF 中 AT2 细胞丰度降低的病理特征;(E)流式示例显示，经 CD45 depletion 和 HTII-280 富集后，AT2 细胞纯度从 6.2% 提升至 92%。

图 4：IPF 来源 AT2 细胞 3D 培养增殖与自我更新能力分析

(A)培养 14 天后，IPF 来源肺泡球的集落形成效率(CFE)显著低于健康对照组;(B)28 天折叠扩增分析显示，IPF 肺泡球的增殖能力明显下降，证实 IPF 中 AT2 细胞存在干细胞耗竭现象，与疾病中上皮修复缺陷的病理特征一致。

图 5：IPF 来源肺泡球形态与表型异常分析

(A-B)健康肺泡球主要表现为囊性(中空腔状)或致密折叠两种形态;(C)IPF 肺泡球出现独特的混合形态(兼具囊性与致密结构)，为健康组织所无;(D-F)免疫染色显示健康肺泡球 Ki67 阳性(增殖活跃)，而 IPF 肺泡球几乎无 Ki67 表达;(G-H)健康肺泡球高表达 HTII-280、AQP5、Pro-SPC 等远端上皮标志物，IPF 肺泡球 Pro-SPC 表达缺失、HTII-280 表达减弱;(I)IPF 肺泡球同时表达近端标志物 KRT5 和远端标志物 AQP5，呈现异常混合表型;(J-K)qPCR 验证显示，IPF 肺泡球远端标志物 SFTPC 表达降低，近端气道相关基因表达升高，证实其分化异常。

全文总结

本研究成功建立了一套适用于健康和 IPF 肺组织的高通量 AT2 细胞分离 workflow，通过优化酶促消化条件和自动化 MACS 分选策略，实现了高纯度(健康 95%、IPF90%)、高活力(>87%)AT2 细胞的快速获取，分选效率远超传统 FACS 方法，且分离后细胞可在 3D 培养中形成功能完整的肺泡球。该方案不仅解决了 IPF 病变组织中 AT2 细胞分离难度大的问题，还通过 3D 培养揭示了 IPF 来源 AT2 细胞在增殖、自我更新及分化上的固有缺陷，为肺纤维化的发病机制研究提供了关键工具。此外，该流程的标准化和高通量特性，为 AT2 细胞规模化生产奠定了基础，对细胞治疗、疾病建模及药物筛选具有重要的临床转化价值。