rs713586风险变异通过ZFP42-TET1介导的DNA甲基化调控ADCY3而非DNAJC27，导致肥胖

基本信息

英文标题：The rs713586 risk variant dysregulates ADCY3 rather than DNAJC27, leading to obesity through ZFP42-TET1-mediated DNA methylation

中文标题：rs713586风险变异通过ZFP42-TET1介导的DNA甲基化调控ADCY3而非DNAJC27，导致肥胖

发表期刊：《eBioMedicine》

影响因子：10.8

作者单位：

河北大学

浙江大学医学院

中国科学院动物研究所等

作者信息：

Weina Wang, Yue Liu, Sheng Dong, Xiaoman Wu, Fei Zhang, Xizhi Wang, Xueying Zhang, Xiaoyu Hu, Zhenshan Wang

研究背景

研究背景：

1.GWAS已识别出多个与肥胖相关的非编码SNP位点，但其功能机制尚不明确。

2.rs713586(风险等位基因C)位于ADCY3与DNAJC27基因之间，二者均被提示与肥胖相关。

3.尚不清楚rs713586主要调控哪个基因，及其分子机制。

4.ADCY3已知与肥胖密切相关，而DNAJC27功能尚存争议。

5.本研究首次揭示rs713586通过ZFP42-TET1轴调控ADCY3表达，而非DNAJC27，导致肥胖。

研究方法

1.生物信息学分析：UK Biobank + GIANT consortium BMI数据，筛选ADCY3区域功能SNP。

2.细胞模型：ARPE-19、SY5Y、3T3-L1、LO2细胞系。

3.基因编辑：

CRISPR/Cas9介导的Dnaic27敲除小鼠

ABE碱基编辑器构建rs713586 T/C和C/C细胞系

CRISPRi/a调控rs713586区域

4.分子机制实验：

双荧光素酶报告基因

ChIP-qPCR、Co-IP

4C-seq(染色质构象捕获)

DNA甲基化分析(亚硫酸氢盐测序)

mRNA-seq转录组分析

5.表型分析：

小鼠体重、脂肪组织H&E染色、代谢笼、行为学(OFT、EPMT、TST、FST)

细胞纤毛长度免疫荧光检测

实验结果

图1：rs713586区域表现出等位基因特异性增强子活性

a. GWAS数据库中ADCY3 SNP位点中与肥胖相关的非编码SNP图。虚线表示 p=1×10−8p=1×10−8。

b. ENCODE数据库中H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3在rs713586区域的表观遗传注释。

c. GTEx数据库中rs713586-C等位基因与神经组织中的ADCY3表达及脂肪组织中的DNAJC27表达相关。

d & e. 双荧光素酶报告实验显示，rs713586-C等位基因在SY5Y、ARPE-19、3T3-L1细胞中显著降低ADCY4(d)和DNAJC27(e)启动子活性。

f & g. CRISPRa(f)和CRISPRi(g)调控rs713586区域后ADCY3和DNAJC27的mRNA表达变化。

h–k. Western blot验证CRISPRa(h, i)和CRISPRi(j, k)对ADCY3和DNAJC27蛋白水平的影响。

图2：rs713586变异损害ADCY3和DNAJC27表达并导致初级纤毛缩短

a. ABE介导的rs713586区域靶向编辑示意图。

b. ABE编辑后ARPE-19细胞中rs713586位点的Sanger测序结果。

c & d. 不同rs713586等位基因细胞中ADCY3(c)和DNAJC27(d)蛋白表达Western blot。

e–g. 4C-seq分析显示rs713586-C等位基因与ADCY3(f)和DNAJC27(g)启动子相互作用显著减弱。

h–j. 免疫荧光染色显示rs713586-C细胞纤毛长度显著缩短(j)，但纤毛比例无变化(i)。

图3：Dnaic27缺失小鼠不发展为肥胖

a. CRISPR/Cas9介导的Dnaic27基因敲除示意图。

b. Dnaic27敲除小鼠基因型鉴定。

c & d. 下丘脑中Dnaic27蛋白表达验证。

e & f. SCD或HFD喂养下，Dnaic27-KO小鼠体重无显著差异。

g. HFD下Dnaic27-KO小鼠摄食量略有增加。

h–j. 白色脂肪和棕色脂肪组织H&E染色显示无显著变化。

图4：Enh区域介导rs713586对ADCY3的调控

a. ENCODE数据库中Enh区域的H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3修饰。

b. 双荧光素酶报告实验显示Enh增强rs713586-T对ADCY3启动子的激活作用。

c. 4C-seq显示rs713586-C与Enh区域相互作用减弱。

d. CRISPRi靶向Enh后ADCY3表达下降。

e & f. Sanger测序和凝胶电泳验证Enh敲除。

g–j. Western blot显示Enh敲除后ADCY3表达下降。

图5：rs713586-C风险等位基因对ZFP42结合力降低，导致ADCY3表达下降

a. ZFP42与rs713586-T非风险等位基因结合的示意图。

b. 双荧光素酶实验显示ZFP42显著增强rs713586-T介导的ADCY3启动子活性。

c. Enh敲除后ZFP42过表达不再上调ADCY3。

d. ChIP-qPCR显示ZFP42优先结合rs713586-T等位基因。

e & f. ZFP42过表达上调ADCY3。

g–i. ZFP42敲低下调ADCY3。

图6：TET1介导rs713586位点对ADCY3表达的影响

a. Co-IP显示ZFP42与TET1相互作用，在rs713586-T细胞中更强。

b & c. ZFP42敲低(b)或过表达(c)影响TET1表达。

d. TET1过表达上调ADCY3。

e & f. 亚硫酸氢盐测序显示rs713586-C细胞中ADCY3启动子(e)和Enh区域(f)甲基化水平显著升高。

g. ChIP-qPCR显示TET1直接结合ADCY3启动子和Enh区域。

研究结论

文献意义:

1.首次明确rs713586的功能靶基因为ADCY3而非DNAJC27：通过Dnaic27敲除小鼠模型，提供了体内直接证据，排除了DNAJC27在rs713586介导肥胖中的关键作用，纠正了GWAS关联研究可能带来的因果方向误判。

2.首次提出rs713586-ZFP42-TET1-ADCY3表观遗传调控轴：完整揭示了非编码SNP通过影响转录因子结合、改变DNA甲基化水平、调控靶基因表达的级联机制，为非编码变异功能解析提供了范式。

3.连接遗传变异与表观遗传调控：证实rs713586作为meQTL，通过ZFP42-TET1互作影响局部DNA甲基化，从而调控ADCY3表达，为理解肥胖相关非编码SNP的作用机制提供了新视角。

4.为肥胖治疗提供潜在新靶点：由于TET1位于该调控轴的关键节点，且其活性可被调控，研究提示TET1激动剂可能用于逆转rs713586-C风险等位基因导致的ADCY3低表达，具有治疗转化潜力。

5.强调非编码区域功能研究的重要性：本研究展示了如何系统性地从GWAS关联信号中鉴定出真正的功能性变异和靶基因，为复杂疾病遗传学研究提供了可借鉴的策略。

6.局限性讨论具有指导意义：明确指出小鼠与人类基因组在rs713586及Enh区域缺乏保守性，解释了为何无法直接构建小鼠模型，并对DNAJC27在人类肥胖中的潜在作用保持审慎，体现了严谨的科学态度。