基于 NanoLuc 筛选鉴定鞣花酸为天然 GPR35 激动剂用于溃疡性结肠炎治疗

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Identification of Ellagic Acid as a Natural GPR35 Agonist for Ulcerative Colitis Therapy

中文标题：基于NanoLuc筛选鉴定鞣花酸为天然GPR35激动剂用于溃疡性结肠炎治疗

发表期刊：《Biomolecules》

影响因子：4.8

作者单位：

1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

2.Zhongshan Institute for Drug Discovery, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Zhongshan 528400, China

3.Shanghai Academy of International Standardization for Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

作者信息：

第一作者 Haichao Liu、Le Yang(共同一作)通讯作者 Zhenwei Li、Dean Guo

研究背景

溃疡性结肠炎(UC)是全球高发的慢性炎症性肠病，现有治疗药物存在副作用明显、易耐药等局限，G 蛋白偶联受体 35(GPR35)是维持肠道稳态、促进肠上皮修复的关键靶点，而膳食多酚能否通过直接激活 GPR35 发挥 UC 治疗作用尚不明确;本研究首次利用基于 NanoLuc 的 NanoBiT 技术从 30 种天然多酚化合物中筛选潜在 GPR35 激动剂，发现鞣花酸(EA)为强效 GPR35 激动剂，进一步探究其结合机制与体内外抗 UC 效果，为 UC 的天然药物靶向治疗提供新依据。

研究方法

本研究以 HEK293T 细胞为载体构建基于 NanoLuc 的 NanoBiT 与 BRET 检测体系，筛选 30 种膳食多酚的 GPR35 激动活性并验证剂量效应;通过分子对接预测 EA 与 GPR35 的结合模式，定点突变结合 NanoLuc-NanoBiT 实验验证关键结合残基，分子动力学模拟评估复合物稳定性;构建 DSS 诱导的 C57BL/6J 小鼠 UC 模型，以 60mg/kg EA 灌胃干预，评估疾病活动指数、结肠长度与组织病理变化;采用人结肠上皮细胞 NCM460 进行划痕愈合与 SRB 增殖实验，联合 GPR35 拮抗剂 CID2745687 验证 EA 作用的 GPR35 依赖性，免疫荧光检测肠道紧密连接蛋白 ZO-1 的表达。

实验结果

图1 基于 NanoLuc 的 NanoBiT 筛选鉴定 EA 为 GPR35 强效激动剂

采用 NanoLuc 介导的 NanoBiTβ-arrestin2 招募实验对 30 种多酚进行筛选，10μM 浓度下鞣花酸(EA)对人 GPR35 的激活效应显著优于其他化合物，且呈浓度依赖性激活人源与鼠源 GPR35;BRET 实验进一步证实 EA 可浓度依赖性招募 Gα13 蛋白，明确 EA 为种属交叉的 GPR35 天然强效激动剂。

图2 EA 与 GPR35 的分子对接结合模式解析

分子对接结果显示 EA 紧密结合于 GPR35 的跨膜结合口袋，结合能为 - 8.709 kcal/mol，与 Gln93、Arg100、Arg151、Phe163、Ser262 等残基形成氢键、π-π 堆积、盐桥等稳定相互作用，为 EA-GPR35 结合的实验验证提供精准结构基础。

图3 定点突变结合 NanoLuc 实验验证 GPR35 关键结合位点

对 GPR35 的 8 个潜在结合位点进行定点突变，基于 NanoLuc 的 NanoBiT 实验显示 Q93A、R100A、R151A、F163A、S262A 突变可完全消除 EA 对 GPR35 的激活作用，L97A、R240A 显著降低激活效率，H168A 无明显影响，确定 EA 激活 GPR35 的核心结合残基。

图4 分子动力学模拟证实 GPR35-EA 复合物高度稳定

200ns 分子动力学模拟结果显示，GPR35-EA 复合物的 RMSD、回转半径、溶剂可及表面积与残基波动均稳定在合理范围，持续维持 2-4 个分子间氢键，自由能景观呈单一低能构象，结合自由能为 - 32.58 kcal/mol，证实对接构象具备生理条件下的稳定性。

图5 EA 显著缓解 DSS 诱导的小鼠 UC 临床症状

DSS 诱导的 UC 小鼠出现进行性体重下降、疾病活动指数(DAI)升高、结肠长度缩短，60mg/kg EA 灌胃干预 8 天后，可显著改善小鼠体重丢失、降低 DAI 评分、恢复结肠长度，直观证实 EA 在体内的抗 UC 疗效。

图6 EA 保护结肠组织结构与肠道屏障完整性

H&E 染色显示模型组小鼠结肠出现上皮损伤、隐窝消失、大量炎症细胞浸润，EA 治疗后结肠组织损伤显著修复;免疫荧光结果显示 EA 可恢复肠道紧密连接蛋白 ZO-1 的表达，有效维持肠道屏障功能，减少肠道炎症渗漏。

图7 EA 通过激活 GPR35 促进肠上皮细胞修复增殖

NCM460 细胞划痕愈合与 SRB 增殖实验表明，EA 可显著促进肠上皮细胞的迁移与增殖;该促修复效应可被 GPR35 特异性拮抗剂 CID2745687 完全阻断，证明 EA 促进肠上皮修复的作用完全依赖 GPR35 的激活。

研究结论

本研究基于 NanoLuc 的 NanoBiT 技术从 30 种天然多酚中成功筛选出鞣花酸(EA)为 GPR35 强效天然激动剂，分子对接、定点突变与分子动力学模拟明确 Gln93、Arg100、Arg151、Phe163、Ser262 为 EA 与 GPR35 的关键结合位点;体内实验证实 EA 可有效缓解 DSS 诱导的小鼠 UC 症状、修复结肠黏膜损伤、维持肠道屏障功能，体外实验证明其通过特异性激活 GPR35 促进肠上皮细胞迁移与增殖，为溃疡性结肠炎提供了全新的天然 GPR35 靶向治疗策略。